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医技

【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇临床微生物检验11-20

作者:王泓日期:2014-06-19

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11.肺炎链球菌检验

【临床意义】

肺炎链球菌寄生于人的上呼吸道，一般不致病，致病物质主要靠荚膜的侵袭作用。当机体抵抗力下降时，如寒冷刺激、感冒，可引起大叶肺炎或支气管炎。此外，肺炎链球菌还可以引起中耳炎、乳突炎、脑膜炎、菌血症等。近年来耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP）及多重耐药株的增加，给临床治疗带来一定困难。若苯唑西林（每片1μg）≤19mm时，应检测菌株对青霉素、头孢曲松、头孢噻肟的MIC值，并根据脑膜炎和非脑膜炎判定敏感、中介和耐药。药敏试验显示儿童株和成人株对红霉素和克林霉素耐药率均极高，两者中均出现少数喹诺酮类抗菌药物耐药株，未发现万古霉素耐药株。

【标本要求】

1.最好在应用抗生素前采集标本，标本采集后立即送检。

2.留取痰、咽拭子，以晨起后采集为佳。

3.脑脊液、支气管肺泡灌洗液、气管抽出液、肺穿刺或活组织等。

【方法与原理】

Optochin的敏感性：试验细菌对化学药品奥普托欣（Optochin）的敏感性，用于检查肺炎链球菌细胞膜脆性，用于鉴别肺炎链球菌（敏感）与其他α-溶血链球菌菌种（耐药）。

【仪器】

CO₂培养箱。

【试剂】

1.血平皿。

2.Optochin纸片。

3.肺炎链球菌快速乳胶凝集试剂（法国生物梅里埃公司）。

【操作步骤】

1.增菌与分离呼吸道标本接种血平皿原始点，接种环划线接种，35℃5%CO₂环境中孵育24小时，观察结果。

2.鉴定

（1） Optochin纸片的制备：每片含5μg的Optochin，（直径6mm滤纸片用0. 02ml的1: 4000水稀释的Optochin浸泡，并在37℃干燥）。在冰箱或室温下保存9个月不失效，但建议冰箱保存较好。Optochin纸片要定期用已知敏感的肺炎链球菌作质控。

（2）试验菌的接种必须挑选纯菌落，用接种环取生长在血琼脂平皿上扁平或中心塌陷，呈脐窝状、有α溶血的圆形，表面光滑，边缘整齐的菌落，密涂在含5%绵羊血的血琼脂平皿上，取一片Optochin纸片贴于划线中间，放置35℃的5%～7%的CO₂环境中孵育20～24小时。判读结果：抑菌圈≥14mm为阳性。

（3）Optochin敏感（S）：即纸片周围生长物被抑制，有清楚的抑菌圈，抑菌直径可达≥14mm的是肺炎链球菌。不敏感（R）：即纸片周围有生长物，没有抑菌圈的是其他草绿色溶血链球菌。Optochin试验不典型的采用肺炎链球菌快速乳胶凝集试剂确证（法国生物梅里埃公司）。

（4）质控菌：ATCC49619肺炎链球菌。

【参考范围】

正常上呼吸道标本可检测到肺炎链球菌，其致病性需结合临床症状。

12.卡他莫拉菌检验

【临床意义】

卡他莫拉菌过去被认为是上呼吸道的正常菌群，现在本菌的致病意义越来越被临床重视，特别是在老年人中引起慢性阻塞性肺疾病（COPD），在慢性支气管炎发作患者的痰标本中卡他莫拉菌的分离率仅次于流感嗜血杆菌、肺炎链球菌。过去卡他莫拉菌对青霉素类抗生素高度敏感，但近年来该菌株产β内酰胺酶率很高，可水解青霉素类抗生素，导致耐药。药敏试验显示卡他莫拉菌对头孢菌素类、阿莫西林／克拉维酸、左氧氟沙星敏感率均很高，但对阿奇霉素和克林霉素的敏感率较低。

【标本要求】

1.最好在应用抗生素前采集标本，标本采集后立即送检。

2.留取痰、咽拭子，以晨起后采集为佳。

3.支气管肺泡灌洗液、气管抽出液、肺穿刺或活组织等。

【方法与原理】

1.生化反应对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖都不利用。氧化酶阳性、硝酸盐阳性、DNA酶阳性。在所有奈瑟菌属中只有卡他莫拉菌DNA酶试验阳性。

2.氧化酶试验原理细菌存在细胞色素氧化酶系统，通过分子氧激活还原态细胞色素的氧化作用。

3.硝酸盐试验原理检查细菌还原硝酸盐为亚硝酸盐或游离氮气的能力。

4.DNA酶试验原理测定细菌合成能解聚（降解）脱氧核糖核酸（DNA）的脱氧核糖核酸酶（DNAase）的能力。

【仪器】

CO₂培养箱。

【试剂与材料】

1.血琼脂平皿、巧克力琼脂平皿。

2.DNA酶试验琼脂培养基。

3.氧化酶试验纸片。

4.硝酸钾培养基。

【操作步骤】

1.增菌与分离呼吸道标本接种血平皿、巧克力平皿、中国蓝平皿接种环划线，35℃5% CO₂环境中孵育24小时，观察结果见表3-10。

表3-10 卡他奠拉菌与其他常见奈瑟菌的鉴别

35℃营养琼脂	22℃巧克力琼脂或血琼脂	糖产酸试验
35℃营养琼脂	22℃巧克力琼脂或血琼脂	葡萄糖	麦芽糖	乳糖	硝酸盐	DNA酶
淋病奈瑟菌	0	0	+	0	0	0	0
脑膜炎奈瑟菌	v	0	+	+	0	0	0
乳屑奈瑟菌	+	v	+	+	+	0	0
卡他莫拉菌	+	+	0	0	0	+	+

注：v表示可变

2.在巧克力平皿上挑菌落颜色呈浅粉色一棕色，不透明，直径1～3mm，干的，“曲棍球”样。用接种环可将菌落整齐地切开，用接种环轻推整个菌落可在琼脂上滑动，在盐水中很容易溶解。硝酸盐试验阳性（+）、氧化酶试验阳性（+）、DNA酶试验阳性（+）为卡他莫拉菌。需检测β内酰胺酶。

【参考范围】

正常上呼吸道标本可检测到卡他莫拉菌，其致病性需结合临床症状。

13.生殖道标本的微生物检验

【临床意义】

1.从正常情况下的无菌部位分离出的微生物通常被认为有致病意义。

2.若生殖道分离出淋病奈瑟球菌、B群链球菌、杜克嗜血杆菌、志贺菌属和白念珠菌、肠杆菌科菌等，则有致病意义。

3.若分离出其他病原体则必须与相关的临床症状或其他因素（如怀孕等）综合分析。

【标本要求】

1.阴道、子宫颈陷凹、子宫内膜、生殖道创伤、前庭大腺、羊水膜及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌试管内送检。

2.淋病奈瑟菌检查时，不论男女尿道及子宫颈均需用拭子插入尿道及子宫颈3cm深取样送检，女性要避免受阴道分泌物污染。

【原理】

有宫颈炎、外阴阴道炎、尿道炎、细菌性阴道炎、输卵管炎或子宫内膜炎的临床症状的女性患者可采集生殖道标本送临床微生物实验室进行检验。孕妇的生殖道标本也可送检以诊断是否存在会引起新生儿疾病的微生物。不同的病原体有不同的培养和检测要求，因此常常需要选择性培养基。某些病原体如淋病奈瑟菌、杜克嗜血杆菌或B群链球菌，需要特殊申请、适当的采集以及接种选择性培养基。生殖道是开放器官，标本采集量应严格无菌操作以减少杂菌污染。阴道内有大量正常菌群存在，采集宫颈标本时应避免触及阴道壁。不能用棉拭子取样，应用专门的涤纶拭子。

【仪器】

1. 35℃孵箱。

2.BD Phoenix全自动微生物鉴定／药敏分析仪。

3.Vitek Compact全自动微生物鉴定仪。

【试剂与材料】

1.用英国OXOID公司的产品制作的各种培养皿：中国蓝平皿、血平皿、G⁺巧克力琼脂平皿、沙保弱培养基。

2.配套微生物鉴定仪的鉴定／药敏卡。

3.各种手工鉴定小管、氧化酶纸片、触酶（3%H₂O₂）、金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验。

4.Chromagar显色培养基。

【操作步骤】

1.普通培养标本接种于血平皿、中国蓝平皿，置35℃孵箱培养过夜，根据生长在不同平皿上的不同菌落特点，做革兰染色、手工鉴定或使用全自动微生物鉴定仪→药敏试验→报告结果。如医嘱查淋病奈瑟菌需接种G⁺巧克力琼脂平皿，CO₂孵箱35℃孵育24～48小时。

2.真菌培养接种沙保弱琼脂斜面，28℃孵育7～14天。

3.直接涂片分泌物涂片后经自然干燥，固定后做革兰染色，根据染色的细菌形态，初步报告：提示感染细菌的种类。

4.生殖道标本中常见病原菌见表3-11。

表3-11 生殖道标本中常见病原菌

革兰阳性菌	革兰阴性菌
葡萄球菌属（腐生葡萄球菌、金黄色葡萄球菌等）肠球菌属链球菌属消化链球菌结核分枝杆菌酵母样菌	淋病奈瑟菌肠杆菌科菌拟杆菌属铜绿假单胞菌变形杆菌属阴道加德纳菌杜克嗜血杆菌

【参考文献】

陈东科，孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱.北京：人民卫生出版社，2011

14.粪便难辨梭状芽胞杆菌检验

【临床意义】

使用某些抗生素的患者，肠道菌群失调，难辨梭菌可被药物选择出后大量繁殖而致病。其所产的毒素能直接损伤肠壁细胞，造成抗生素诱发性肠炎、严重时呈伪膜性肠炎。治疗：首先停用诱发的抗生素，第二步使用甲硝唑，或万古霉素（但万古霉素的使用可能诱发耐万古霉素的肠球菌的产生）。

【标本要求】

粪便，5～10ml，置于带密封盖无菌试管内，及时送检。

【方法与原理】

厌氧气袋法。

【仪器与材料】

37℃孵箱、厌氧气袋（法国生物梅里埃公司）。

【培养基】

CCFA（含环丝氨酸、头孢西丁、果糖的卵黄琼脂）。

【操作步骤】

1.将粪便标本直接接种于CCFA选择培养基，密封于厌养袋中（袋中放指示条和气体发生袋）。

2.经48小时培养，挑取菌落直径3～5mm，圆形，略凸起、白色或淡黄色、边缘不整、表面粗糙的菌落，传代分纯，同时做耐氧试验。

3.涂片，做革兰染色，镜检。

4.耐氧试验应阴性。

5.根据菌落形态，及菌落在紫外线照射下，可见黄绿色荧光，显微镜检革兰阳性杆菌，中等大小，芽胞少见，耐氧试验阴性，在普通厌氧血碟上产芽胞较多等特征。做API 20A生化鉴定此菌可确定。最好检测难辨梭菌毒素抗原以确诊。

【参考范围】

无难辨梭状芽胞杆菌生长。

15.粪便标本的微生物检验

【临床意义】

1.肠道病原菌可引起人类感染性腹泻，也可由细菌代谢产物造成食物中毒，长期应用抗生素导致菌群紊乱也可引起严重腹泻，因此，应及早作出诊断，以免延误治疗。

2.健康人体肠道内有许多正常菌群寄居，包括大量厌氧菌和大肠杆菌，肠杆菌等。

3.肠道致病菌主要有沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、难辨梭菌、白念珠菌、结核分枝杆菌、气单胞菌、邻单胞菌和蜡样芽胞杆菌。

4.致病性大肠杆菌包括5种类型肠毒素型大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭型大肠杆菌（EIEC）、肠致病型大肠杆菌（EPEC）、肠出血型大肠杆菌（EHEC）和肠凝聚型大肠杆菌（EAggEC）。志贺菌属是肠杆菌科中引起人类感染性腹泻最常见的致病菌之一，主要引起人类细菌性痢疾，其中福氏和宋内志贺菌最为常见。菌痢主要有三种临床类型：急性细菌性痢疾、慢性细菌性痢疾和携带者。典型的急性菌痢初期为水样便，数日后为脓血便，伴有里急后重现象。

5.沙门菌有较强的内毒素，可使体温升高，白细胞减少。主要通过污染食品和水源经口感染，临床上表现主要为三种类型：①肠热症：表现为发热，血培养或肥达反应阳性。②胃肠炎：此型最常见，引起轻型和爆发型腹泻，伴有低热，恶心和呕吐。③菌血症和败血症：多发生于儿童和免疫力低下的成年人，病原菌随血至组织，导致脑膜炎、心内膜炎、胆囊炎、骨髓炎等。往往出现血培养阳性而粪便培养阴性。

6.出血性大肠杆菌引起严重的出血性肠炎，可发生在任何年龄，年龄小和老者死亡率高。少数患者并发溶血性尿毒综合征（HUS）。临床表现为低热，痉挛性腹泻，开始水样便，继而血样便。此病的诊断完全依靠细菌学检查，生化特征为不发酵山梨醇，可进行筛查。

【标本要求】

1.粪便标本虽然含有多种杂菌，但应尽量使用无菌容器，采集新鲜粪便做培养。

2.标本最好在用药前采集。

3.腹泻患者应尽量在急性期采集标本（3天以内），以提高阳性率。

4.采集脓血或黏液部分的新鲜粪便2～3g，液状粪便应挑取絮状物2～3ml。

5.不易获得粪便时，可采用直肠拭子采样，即用无菌棉拭子经生理盐水湿润后，插入肛门内4～5cm（幼儿2～3cm）处，轻轻转动后取出，然后将拭子置于运送培养基或无菌试管内。

6.标本置于无菌盒内、运送培养基或增菌培养基中立即送检。

7.检查粪便中难辨梭菌，标本应尽量避免与空气接触，将标本置于密封盖试管中，量约试管2/3高度。

【仪器】

25℃孵箱和37℃孵箱。

【试剂】

1.XLD（xylose lysine desoxycholate）琼脂平皿粪便标本中常见病原菌在XLD琼脂平皿上生长为红色或有黑心菌落。

2.山梨醇琼脂平皿大肠杆菌（O157）在山梨醇平皿上生长，利用山梨醇为无色透明菌落。

3.CCFA琼脂平皿选出艰难梭状芽胞杆菌。

4.庆大霉素平皿查霍乱弧菌。

5.碱性蛋白胨水查霍乱弧菌。

6.赛保罗平皿查真菌。

7.沙门菌、志贺菌及大肠杆菌O15 7:H7鉴定血清。

【操作步骤】

1.志贺菌属检验粪便标本→XLD平皿，37℃孵箱培养过夜→挑取可疑菌落（红色）转种克氏双糖培养基过夜→乳糖（-）、葡萄糖（+）、产气（-）、H₂S（-）、动力（-）→志贺菌血清凝集和药敏试验→报告。

2.沙门菌属检验粪便标本→XLD平皿，37℃孵箱培养过夜→挑取可疑菌落（红色、或有黑心）转种克氏双糖培养基培养过夜→乳糖（-）、葡萄糖（+）、产气（+）、H₂S（+）、动力（+）→沙门菌血清凝集和药敏试验→报告。

3.大肠杆菌O157：H7 检验粪便标本→山梨醇平皿，37℃孵箱培养过夜→挑取可疑菌落（无色、透明）转种克氏双糖培养基培养过夜→乳糖（+）、葡萄糖（+）、产气（+）、H₂S（-）、动力（+）→大肠杆菌O157：H7凝集试验→报告。

4.霍乱弧菌检验取米泔样粪便2ml，接种于碱性蛋白胨水中，35℃增菌6小时后，取表面生长物或菌膜，用划线分离法接种庆大霉素平皿，35℃培养18～24小时，观察有无灰青色菌落，挑取可疑菌落与霍乱弧菌O1和O139诊断血清分别做玻片凝集试验。

5.难辨梭状芽胞杆菌检验取送检试管中深部的液状粪便接种CCFA平皿，35℃厌氧环境培养48小时后，挑选不透明，黄色，边缘不整齐的粗糙型菌落，做革兰染色，如看到革兰阳性杆菌且次极端有卵圆形芽胞，做进一步生化鉴定。

6.真菌检验将标本接种赛保罗平皿，25℃和35℃培养，根据染色形态，菌落特征及生化试验进一步鉴定。

16.厌氧菌检验

【临床意义】

厌氧菌可以引起人类多种感染，包括阑尾炎、胆囊炎、牙和口腔感染、心内膜炎、脑脓肿、骨髓炎、腹膜炎、关节炎、肝脓肿、鼻窦炎、外科伤口感染、中耳炎、菌血症等。早期诊断厌氧菌，对患者的治疗有重要的意义。

【方法与原理】

在无氧（或少氧）条件下，或氧化还原电势低的条件下才能繁殖的细菌称为厌氧菌。因为厌氧菌在人体肠道、口腔、泌尿生殖道正常菌群中占优势，所以当人体菌群失调时，厌氧菌可能侵犯人体许多部位，发生严重的甚至致死的内源性厌氧菌感染。厌氧菌感染常发生在深部伤口，但也可伴兼性厌氧菌和需氧菌侵犯人体任何器官和组织，根据文献统计深部感染约一半以上有厌氧菌参与。所以，对任何深部感染应开展厌氧菌的检验。

要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。厌氧产气袋GENbag anaer内含活性炭、抗坏血酸钠盐和其他有机和无机成分，吸收O₂释放CO₂（不需钯催化剂）。功效：在2.5小时使气袋中含O₂ ＜0.1%，CO₂气体在24小时后浓度＞15%。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。袋内在半小时内造成无气环境。化学指示剂条由蓝色变为白色，即表示袋内已达厌氧状态。

【仪器】

普通孵箱、CO₂孵箱、塑料厌氧袋（法国梅里埃公司）、塑料密封夹子。

【试剂】

厌氧产气袋、化学指示剂（法国梅里埃公司）、革兰染液、厌氧血平皿、血平皿、巧克力平皿、API 20A鉴定条（法国梅里埃公司）。

【操作步骤】

1.培养物的接种多种液体和固体培养基，包括各种选择培养基可用于临床标本的初代接种。补加还原剂和经预还原的培养基，培养效果较好。非选择培养基和卡那霉素-万古霉素冻溶血琼脂培养基两者结合起来可将厌氧菌检出率提高到94%。采用50%乙醇与标本混合作用1小时是选择分离芽胞梭菌的有效方法，标本收集后应尽快接种，操作方法如下：

（1）被检标本是组织块，则立即将其移入无菌的组织研磨器内，最好在厌氧箱内或无氧条件下操作。组织匀浆液的接种方法与液体标本相同。

（2）如收到的标本是液体的，则用毛细吸管滴加1滴或数滴于含维生素K1（10μg/ml）和氯化血红素（5μg／ml）的布鲁血琼脂平板（BRBA），三区划线后，以保证长出单个菌落。接种完毕，立即将平皿放至厌氧袋内，打开厌氧产气袋，将它和化学指示剂一起置于厌氧袋内，赶走袋内空气，用2个塑料夹子密闭，置于35℃普通孵育培养。

（3）血液标本直接接种至厌氧瓶。

（4）无菌体液标本可以直接接种厌氧瓶，也可以接种至BRBA平皿。

（5）假如可疑含有芽胞梭菌，还要用乙醇或加热处理标本。

（6）接种的同时，对标本做直接涂片革兰染色检查。

2.直接涂片检查原始标本接种培养基后涂片。通常拭子上的剩余标本是足够用来涂片的。涂片检查可看出有无细菌，微生物的类型、大概的数量以及芽胞、形状和位置（芽胞梭菌）、革兰阳性菌分枝的特征（放线菌），成对或链状排列的革兰阳性球菌（葡萄球菌、链球菌、厌氧球菌）和圆形或尖形末端的革兰阴性杆菌（类杆菌和梭杆菌）。同时，还可看到厌氧菌的多形性和着色不匀性。这些初步结果应该及时向主管医生报告，以帮助他们正确选用抗菌药物。涂片检查可核对培养结果，是实验室质量控制的一个重要指标。

3.培养物的孵育所有的平板初次厌氧孵育最少需48小时（生长慢的微生物可能需达7天），若不足48小时将厌氧罐打开，即便再重新厌氧孵育，那些对氧高度敏感的厌氧菌株也会终止生长。

4.培养物的检查经适当孵育后，从厌氧袋里取出所有平板，1次仅取空1个厌氧罐以减少平皿不必要的暴露，用放大镜检查平板上的细菌生长情况。将观察到的菌落类型记录下来，然后按以下步骤进行处理：

（1）耐氧试验

a）挑取每种不同类型的菌落分别接种：纯BRBA平板，在厌氧环境下；巧克力琼脂平板，置CO₂条件下；BRBA平板，在需氧条件下。

b）厌氧BRBA平板，CO₂平板孵育48小时，需氧培养孵育18～24小时。同时要在紫外线下检查初代分离BRBA平板上是否存在产黑色Porphyromonas及Prevotella的菌落，其特征是发砖红色荧光。

c）判读：如果厌氧培养生长物在厌氧环境和大气环境中均生长，说明该被检厌氧培养生长物为兼性厌氧菌；如果被检厌氧培养生长物在厌氧环境生长，而在大气环境中未生长，说明该被检厌氧培养生长物为专性厌氧菌。

d）耐氧试验阴性：过夜和48小时孵育后，分别检查次代培养的需氧平板和CO₂平板，如果有菌生长，则可能不是厌氧菌。应按需氧鉴定程序进行鉴定。

e）耐氧试验阳性：经48小时孵育后，需氧环境和CO₂平板均不长，而厌氧环境生长，应记录次代培养的生长情况及溶血、色素产生、琼脂凹陷和菌落形态等。如菌量足够，可以采用API 20A鉴定条立即对此菌进行生化鉴定。

（2）鉴定

a）结合耐氧试验、革兰染色、细菌形态和菌落特点可以初步推断厌氧群或属。见表3-12～表3-14。

表3-12 厌氧革兰阴性菌的菌落形态和革兰染色特征

种名	BRBA形态	革兰染色	Indole试验
脆弱拟杆菌群解脲拟杆菌具核梭杆菌卟啉单胞菌普雷沃菌韦荣球菌	大、凸起透明（15%触酶阴性）乳白色、面包屑小、透明或不透明，布鲁琼脂上砖红色小、透明或不透明，布鲁琼脂上砖红色小、透明或不透明，布鲁琼脂上砖红色	规则、革兰阴性小杆菌、球杆菌梭形、细尖小的球杆菌小的双球菌	NA 阴性阳性阳性 +/- 阴性

表3-13 厌氧革兰阳性菌的菌落形态和革兰染色特征

种名	BRBA形态	革兰染色	Indole试验
难辨梭菌产气荚膜梭菌败毒梭菌索氏梭菌败伤风梭菌消化链球菌痤疮丙酸杆菌	大、扁平菌落；畜牧场的味道大的、无规则形态.beta-双溶血环蜂窝状很大的、叶状、不规则、扁平蜂窝状，生长缓慢小的、尖的，圆的小的、不透明的、圆形、白色（15%触酶阳性）	细杆、芽胞很少列车样、大的、方杆菌细杆，次级端芽胞细杆，次级端芽胞肿胀的末端芽胞球、对、链棒杆菌	阴性 NA 阴性阳性阳性 NA 阳性

b） API 20A的操作和判读参照《API 20A操作程序》。

c）特殊情况，当无API鉴定条时，下表有利于厌氧革兰阴性菌的菌种鉴定：其中包括对含一定量抗生素纸片的敏感性（包括卡那霉素纸片每片1mg，万古霉素纸片每片5 μg，多黏菌素E纸片每片10μg）。厌氧菌纯培养抑菌环大于等于10mm为敏感。靛基质、硝酸盐纸片、触酶等简便的试验推断厌氧菌群、属和菌株的种名。

表3-14 实验室革兰阴性厌氧菌生化反应结果

厌氧菌种类

细胞形态

卡那霉素

万古霉素

黏菌素

20%胆汁生长

触酶

靛基质

脂酶

硝酸盐还原

尿素酶

动力

凹痕

砖红色荧光

脆弱类杆菌群

其他类杆菌

-/+

产色素杆菌

P.中间型杆菌

CB/B

-/+

P.loescheii

-/+

类解脲类杆菌群

解脲类杆菌

B.gracilis

Wolinella

梭状杆菌属

核梭杆菌

坏死梭杆菌

-/+

变异-死亡梭杆菌

革兰阴性球菌属

韦荣球菌属

-/+

注：拟杆菌与类杆菌通用，R:耐药，S:敏感，V:不定，P:Prevotella；甲酸盐、延胡索酸盐刺激生长阳性

（3）结果报告

a）快速的初步报告对临床非常有价值。由于许多厌氧菌生长缓慢，常常需要几天的时间才能鉴定到属或种水平，因此，实验室应当尽可能快速将初步鉴定的结果回报给临床医生。

b）对来自血、脑脊液和其他无菌体液的标本，电话报告革兰染色和初步耐氧试验的结果。

c）对任何符合厌氧送检要求的标本最终报告格式如下：“厌氧培养，经鉴定发现×××”，×××代表种名。

【参考范围】

正常人组织、血液、无菌体液厌氧培养阴性。

【参考文献】

1. Murray PR，Baron EJ，Jorgersen JH，et al.Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. Washing ton D.C.:ASM Press，2003

2.Garlia LS. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed. Washing ton D.C.:ASM Press，2007

17.纸片扩散法药敏试验

【临床意义】

1.敏感（S） “敏感”表明使用治疗该部位感染推荐剂量抗菌药物所达到浓度，通常能够抑制该菌株，除非存在禁忌证。

2.中介（Ⅰ） “中介”包括一些菌株，其抗菌药物最低抑菌浓度［MIC］接近于血液和组织中通常可达到的水平，而抗菌药物治疗的反应率可能低于敏感株。“中介”意味着药物在生理浓集的部位具有临床效力（如尿液中的喹诺酮类和β内酰胺类）或者可以使用高于正常剂量的药物进行治疗（如β内酰胺类）。此分类还代表一个缓冲区，它可以防止微小的、未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误，特别是对那些安全范围窄的药物。

3.耐药（R） “耐药”是指常规剂量抗菌药物通常达到的全身浓度，不能抑制菌株的生长。MIC落于某范围内的菌株，可存在某些特定的耐药机制（如β内酰胺酶类），耐药也意味着临床疗效不可靠。

【标本要求】

纸片法药敏试验的菌株包括从临床标本中分离的常见的、快生长细菌，如肠杆菌科菌、葡萄球菌、肠球菌、非发酵菌；还包括某些苛养病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌等。标本中的正常菌群，通常不做药敏试验。

对每一种可能致病的细菌进行敏感试验时，都应使用单个菌落，与此同时进行菌种的鉴定。不同菌种的混合物不能在同一药敏平皿上进行试验。除非临床急症患者的标本经涂片革兰染色提示单一病原菌，或是血培养阳性后进行初步药敏试验，一般应避免直接用临床标本（如通常为无菌体液和尿液）去做药敏试验。若临床标本直接用于药敏试验，必须按标准方法重做第二次。

【方法与原理】

1.纸片扩散法原理将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已涂布测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。

2.药敏试验指征为保证治疗效果，对引起感染的任何病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。尤其当病原菌对常用抗菌药物可能产生耐药时，更需进行药敏试验。若感染是由公认的对某一高效药物敏感的微生物引起，就很少需要进行药敏试验。

3.选药原则详见临床与实验室标准化研究所（CLSI）对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南表。表中的药物可满足绝大多数临床实验室的常规需要，在此表中各种抗菌药物针对具体的菌种或菌群被分成许多纵列，每一列又根据不同的选择要求分成A、B、C、U等不同的组，其中A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。B组包含一些临床上重要、特别针对医院感染的抗菌药物，可用于首选试验，但只是选择性地报告临床。例如当细菌对A组同类药物耐药时，可选择性报告B组中的一些结果。B组其他报告指征包括以下几点：①特定的标本来源（如三代头孢菌素对脑脊液中的肠杆菌，或者磺胺甲■唑／甲氧苄啶对泌尿道的分离菌株）；②多种细菌感染；③多部位感染；④对A组药过敏、耐受或无效的病例；⑤以流行病学调查为目的向感染控制部门报告。C组包括替代性或补充性抗菌药物，可在以下情况进行试验：某些单位潜在有对数种基本药物（特别是同类的，如β内酰胺类或氨基糖苷类）局部流行或广泛流行的耐药菌株；治疗对基本药物过敏的患者；治疗少见菌的感染（如氯霉素对肠道外分离的沙门菌属或耐万古霉素的肠球菌）；以流行病学调查为目的向感染控制部门报告。U组包含某些仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物（如呋喃妥因和某些喹诺酮类药物），这些药物对除泌尿道以外的感染部位分离的病原菌不应常规报告，其他具有较广治疗指征的药物也可包括在U组，其主要针对一些特定的泌尿道致病菌（如铜绿假单胞菌）。表中的小框中是一些类似的药物，同一框内的药物的结果解释和临床效力都很相似，因此不必重复试验，而“或”字表示一组相关的药物，其抗菌谱和结果解释几乎完全相同，所以通常在每个小框中只选择一种药物进行试验。

4.局限性纸片扩散法只适用于大多数快生长的需氧菌，对于许多菌种，如棒杆菌、李斯特菌属、厌氧菌、弯曲菌、脑膜炎奈瑟菌等，无标准的纸片扩散法及判定标准，因为这些菌株可能需要不同的培养基、不同的孵育气体或者菌株间的生长速率有很大差异，纸片法不能可靠地解释其对药物的敏感性，必须做MIC测定。

当用某些抗菌药物对特定细菌进行测试时，可以出现危险的误导性结果，这些组合包括以下几种但并不限于这些：一代、二代头孢菌素和氨基糖苷类菌药物对沙门菌属和志贺菌属；所有β内酰胺类菌药物（除了苯唑西林、甲氧西林和萘夫西林）对耐甲氧西林的葡萄球菌；头孢菌素、氨基糖苷类（除了高水平耐药性测试）、克林霉素、甲氧苄啶／磺胺甲■唑对肠球菌；头孢菌素对李斯特菌属。

某些菌药物的长期应用会促使耐药菌株的出现，因此治疗开始后3～4天内，最初敏感的菌株可能变为耐药株。这最常见于以下情况：三代头孢菌素治疗肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属；所有抗菌药物治疗铜绿假单胞菌和喹诺酮类治疗葡萄球菌。特定条件下，实验室人员需咨询临床医生，了解患者病情的严重程度，可在治疗开始后3～4天前就开始对致病菌株进行重复的药敏试验以确定菌株的耐药性变化。

【仪器】

普通孵箱，纸片接种器（英国Oxoid公司）或镊子，CO₂孵箱，细菌比浊仪（美国BBL公司）。

【试剂】

1.Mueller-Hinton琼脂（MHA）或嗜血杆菌试验用琼脂（HTMA）或含5%羊血的MHA。

2.各种临床常用的含有特定量抗菌药物的干燥纸片，纸片含量参照CLSI指南。

【操作步骤】

1.药敏试验从孵育了18～24小时的非选择性培养基（如血琼脂平皿）上，挑取单个菌落，直接用肉汤或盐水制成菌悬液作为接种物，将浊度调整至0.5麦氏标准。此法称之为直接菌落悬滴法，是检测苛养菌，如嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌和链球菌等的推荐方法，也适用于检测葡萄球菌对甲氧西林或苯唑西林的潜在耐药性。非苛养菌还可采用生长法（详见CLSI M2-A10文件）进行接种物的制备。

MHA平皿最好在接种物悬液浊度调整后15分钟内接种。流感嗜血杆菌采用HTMA（含15μg/ml血红素、15μg／ml β-NAD、5μg／ml酵母粉的MHA），淋病奈瑟菌采用奈瑟菌专用培养基（GCA）；肺炎链球菌及其他链球菌使用加5%羊血的MHA。用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平皿60°以确保接种菌的均匀分布。接种好的平皿在室温下干燥3～5分钟（不要超过15分钟），然后用纸片分配器或无菌镊子将纸片放入琼脂表面并轻压，使纸片与表面完全接触。各纸片中心相距应大于24mm，由于某些药物在纸片放入琼脂平皿后几乎立即扩散，所以一旦纸片放入后就不能再移动，若要重新放置，可用一个新的纸片放在平皿的另一位置。

在纸片贴好后15分钟内将平皿倒置放入35℃孵箱。非苛养菌的药敏解释标准是建立在空气孵育的基础上，一些药物（如氨基糖苷类、大环内酯类和四环素）的抑菌圈直径受CO₂的影响较大，所以非苛养菌不能孵育在CO₂浓度高的环境中。但苛养菌（如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌）则应在5%～10% CO₂环境中孵育。葡萄球菌和肠球菌必须孵育24小时以检测对头孢西丁和万古霉素的耐药性，其他的非苛养菌可在孵育16～18小时后读取结果。流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌应在5%CO₂中孵育，流感嗜血杆菌需16～18小时，肺炎链球菌及其他链球菌需20～24小时，淋病奈瑟菌需20～24小时。

2.结果判读如果接种准确，抑菌圈呈均匀的环状，细菌生长的平面是连续的，若可见明显的单个菌落生长则说明接种菌的浓度太小，应重新进行试验。抑菌圈的直径（包含纸片的直径）可用直尺或游标卡尺测量，读取最近的整毫米数。对于加入血的琼脂平皿（如链球菌），则将平板的盖子移去，在琼脂表面的上方测量并以反射光照明。抑菌圈的边缘应不见细菌的明显生长，若只有用放大镜才可发现的微弱生长的细小菌落则可以忽略。当检测葡萄球菌或肠球菌时，在头孢西丁纸片（葡萄球菌）或万古霉素纸片（肠球菌）周围的抑菌圈内有任何可辨的菌株生长（包括针尖样菌落）则提示耐药。对其他细菌，若在清楚的抑菌圈内有独立的菌落生长，则提示可能接种的菌种不纯，需要重新分离、鉴定和药敏试验，但此菌落也可能为抗菌药物选择出的高频突变耐药株。变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物的抑菌圈内，所以在明显的抑菌圈内有薄膜样爬行生长可以忽略。对于链球菌应检测生长抑制圈而不是溶血抑制圈。对甲氧苄啶和磺胺，拮抗物可使细菌轻微生长，所以抑菌圈直径的检测应不考虑细微生长的部分（生长菌苔的20%或以下）而测量比较明显的边缘。

抑菌圈直径结果的判读也可使用自动化药敏测量仪。

3.报告抑菌圈直径的解释标准参照CLSI／NCCLS标准，可报告细菌对测试的抗菌药物敏感、中介或耐药，某些抗菌药物只能报告敏感，因为目前还未发现对这些药物耐药的菌株。

CLSI／NCCLS中所推荐的药物目前认为是适合于常规药敏试验和报告的药物，这些针对每一菌群所推荐的药物都具有确切的临床疗效，其体外试验的结果也可以接受，为了提高试验报告与临床的相关性，减少滥用广谱抗菌药物造成的多重耐药菌株的流行，每个实验室都应决定表中的哪些药物用于常规报告（A组）和哪些药物仅选择性报告（B组），不过当临床需要时，也应该提供B组常规不报告的药敏结果。一般情况下，报告的药物必须是试验过的，但若另外一种药物的试验可提供对该药更为准确的结果则可以例外，而且通常所试药物应与医院处方手册中的药物相匹配，或者在报告时附加脚注，指明哪些未试药物与所试药物有相似的解释结果，而对不常见的药敏结果则应考虑报告（如肠杆菌科细菌对三代头孢菌素或亚胺培南耐药）。

某些菌种或菌群在进行药敏试验时对抗菌药物的选择和报告有着特殊要求，如：对于沙门菌属和志贺菌属的分离株只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和甲氧苄啶／磺胺甲■唑可用于常规试验和报告，一、二代头孢菌素和氨基糖苷类抗菌药物体外可能对这些菌株有活性，但临床却无效，所以对上述药物不应报告为敏感。此外，沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性；对于肠球菌属，头孢菌素类、氨基糖苷类（仅筛选高水平耐药性）、甲氧苄啶／磺胺甲■唑和克林霉素在体外可能有活性，但在临床上耐药，所以不能报告对这些药物敏感；对于甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS）应报告对所有β内酰胺类（除外新型抗MRS的β内酰胺类药物）耐药；从患有威胁生命的感染（脑膜炎、菌血症、会厌炎和面部蜂窝组织炎）患者的血和脑脊液中分离的流感嗜血杆菌，常规应只报告氨苄西林、一种三代头孢菌素和氯霉素的药敏结果。

苯唑西林的抑菌圈直径≥20mm的肺炎链球菌对青霉素是敏感的（MIC≤0. 06μg/ml）。当苯唑西林纸片筛选试验的直径≤19mm时，可能是对青霉素耐药、中介或敏感，因此对于苯唑西林抑菌圈直径≤19mm的肺炎链球菌菌株应检测青霉素MIC。仅靠苯唑西林抑菌圈直径≤19mm不能报告该菌株对青霉素耐药或者中介。检测肺炎链球菌之外的其他链球菌对青霉素的敏感性时，并不推荐使用苯唑西林纸片试验。从通常无菌的部位（如脑脊液、血液、骨等）分离到的草绿色溶血链球菌菌株，应检测其青霉素的MIC，因为青霉素（和苯唑西林）纸片扩散试验对草绿色链球菌是不可靠的。

4.质控

（1）目的：监测药敏精密度和准确度；监测试剂质量；监测操作者水平。

（2）质控菌

1）粪肠球菌ATCC29212（用于监测MHA中嘧啶的含量是否在可接受范围，同时也可用作高浓度氨基糖苷类抗生素纸片的质控菌）。

2）大肠埃希菌ATCC25922。

3）大肠埃希菌ATCC35 218（仅用于酶抑制剂复合药物，如含克拉维酸、舒巴坦或三唑巴坦药物的质控）。

4）肺炎克雷伯菌ATCC700603（ESBLs试验质控）。

5）铜绿假单胞菌ATCC27853。

6）金黄色葡萄球菌ATCC25923。

（3）质控菌株的保存：若长期保存，可将菌株置于合适的稳定剂中（如含50%胎牛血清的肉汤，含10%～15%甘油的胰酶消化大豆肉汤，脱纤维羊血或脱脂乳），再储存于-20℃或更低（液氮），或处于冻干状态，这样就不会显著改变其抗菌药物敏感性。日常所用的质控培养物则保存于胰酶消化大豆琼脂（非苛养菌）或高营养的巧克力琼脂（苛养菌）上2～8℃放置，每周传种，但传种次数不能超过连续三次，每月都要用冷冻的、冻干的或商品质控物来更新。只要平均抑菌圈直径没有发生由于方法错误造成的有意义的改变，质控培养物就可以一直用于监测试验的精密度和准确度。如果某意外结果提示该菌株的内在敏感性发生改变，就应该换用此质控株的新培养物。

（4）质控操作：将菌株在琼脂平板上进行传种以获得单个菌落，按推荐的接种物制备方法，将菌株进行培养或制成悬液以进行试验，操作按标准纸片扩散法步骤进行，并且使用与临床分离株药敏试验所用相同的抗菌药物纸片。质控结果读取并进行分析，登记在《质控记录表》。

（5）质控范围：参见CLSI 2012 M100-S22。

（6）质控频率

a）日质控：如果每日都做质控，则对于每个抗菌药物／质控菌组合，在连续的20次测试中有一次超出质控范围是允许的，但如果出现一次以上的结果超出质控范围，则应采取纠正措施。

b）周质控：所有质控菌株经过连续20天或30天的测试，若对每一个药物／质控菌组合，每20个抑菌圈直径结果（即一个药物／质控菌组合连续20天的抑菌圈直径结果）中，超出质控范围的不多于1个或每30个抑菌圈直径结果中超出质控范围的不多于3个，则可将日质控转为周质控。使用周质控测试系统时，如果出现一个抑菌圈直径超过质控范围，则需立即采取纠正措施。另外，当药敏试验的任一组成分改变时，如琼脂或抗菌药物纸片批号改变时，均应及时做质控。

若要在试验中新增一种抗菌药物或改变抑菌圈直径测量方法（如将手工测量结果该为自动化仪器测量结果）时，应先连续做20～30天的日质控，若结果可靠稳定再转为周质控。

（7）失控处理：假如失控是由于明显的原因引起，如贴错纸片、用错质控菌、质控菌污染、错误的孵育条件等，则注明原因并立即重做质控。假如没有发现明显的失控原因，则将失控的纸片／质控菌组合立即重做质控，且连续观察5天，记录所有结果，若所有结果恢复正常，则进入常规每周一次质控程序，若仍有结果失控则可能是系统误差，此时应确认：抑菌圈测量是否正确？比浊管／计有否误差？所有实验用品有无过期？保存是否正确？孵育条件是否正确？质控菌株有否污染？质控菌是否为新鲜菌株（孵育时间不超过24小时）?找到原因后立即更正并且再做连续20～30天的质控直至正常。

失控后患者报告能否发出依情况而定，特别要考虑引起失控的原因。处理方法包括停止某些失控药物结果的报告、遇到特殊表型时回顾性分析患者以往药敏信息、使用其他方法检测等。

18.BD Phoenix-100细菌鉴定／药敏

【标本要求】

挑取合适培养基（可用于鉴定和药敏的培养基：加5%绵羊血的胰酶大豆琼脂、加5%绵羊血的哥伦比亚琼脂、加5%马血的哥伦比亚琼脂、巧克力琼脂、麦康凯琼脂、伊红美兰琼脂；只可用于鉴定的培养基：含或不含血的胰酶大豆琼脂、Hektoen肠杆菌琼脂、XLD琼脂、哥伦比亚CAN琼脂、苯乙醇琼脂）上纯培养的菌落。不纯的菌落一定要分纯后再上仪器鉴定。

【方法与原理】

BD Phoenix System是快速全自动细菌鉴定／药敏系统，能应用于临床大多数的革兰阳性需氧和兼性厌氧菌、大多数革兰阴性的需氧和兼性厌氧菌的快速鉴定和药敏实验。

BD Phoenix System鉴定实验：大多数实验是经过改良的经典实验，包括各种反应底物的发酵、氧化、降解和水解反应。还利用显色和荧光底物用于细菌的鉴定。

BD Phoenix System药敏实验：应用微量肉汤稀释法检测细菌的药物敏感性，同时应用了BD公司专利的AST指示剂（氧化还原显色指示剂），能精确地检测出细菌的MIC。

BD Phoenix System对细菌耐药机制检测：包括①产ESBL的肠杆菌；②万古霉素耐药的肠球菌（VRE）；③氨基糖肽类抗菌药物高度耐药的肠球菌（HLAR）；④甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS）；⑤产β内酰胺酶的葡萄球菌（BL）。

【仪器】

美国BD公司生产的全自动Phoenix细菌鉴定系统。仪器组成：比浊仪，孵育／检测箱、Epicenter软件、打印机。

【试剂】

1.鉴定／药敏板（15～25℃保存），包括革兰阳性菌鉴定板和革兰阴性菌鉴定板。

2.肉汤（2～25℃保存），包括鉴定肉汤和药敏肉汤。

3.药敏指示剂（2～8℃保存），启封后14天内保持稳定。

【操作步骤】

1.标本的加样

（1）将鉴定／药敏板放在加样盘上（鉴定／药敏板启封后应2小时内使用）。

（2）在鉴定／药敏板上粘贴Accession条形码或标本信息（在标记鉴定／药敏板时，请勿影响到ID/AST检测孔，请使用无荧光的标记材料）。

（3）将Broth试管放置在加样盘上，ID Broth放在左边，AST Broth放在右边。

（4）用ID Broth配制0.5 McFarland菌悬液。

①使用无菌棉签挑取菌落至ID Broth。

②混匀5秒，等待10秒使气泡消失。

③使用CrystalSpec或PhoenixSpec比浊仪调整菌液浓度（以0.5～0. 6McFarland为佳）。

④配制好的菌液必须在60分钟内完成加样。

⑤请勿使用金属接种环。

（5）在AST Broth中加一滴AST Indicator Solution。

①AST Indicator Solution需在室温时使用。

②若AST Indicator Solution加过多或过少，需丢弃AST Broth，另取一支AST Broth重新滴加。

③加过AST Indicator Solution的AST broth需在2小时内使用或在避光的室温环境中保持8小时。

（6）从ID Broth中转移25μl菌悬液至AST Broth，颠倒混匀，请勿震荡。

（7）将ID Broth和AST Broth分别倾倒入鉴定／药敏板。鉴定／药敏板加样时的角度非常重要，鉴定／药敏板必须放置在加样盘上。

（8）用密封条将鉴定／药敏板封好。

（9）检查每一个反应孔是否充满菌液。加样完成后鉴定／药敏板必须在30分钟内放入仪器中检测。在转移鉴定／药敏板时，请使用鉴定／药敏板转移容器确保鉴定／药敏板保持直立状态。避免将鉴定／药敏板掉落在地板上，导致反应孔交叉污染。

2.鉴定／药敏板信息输入

（1）添加鉴定／药敏板信息。

（2）使用条码扫描器扫描鉴定／药敏板的条形码，使仪器能识别鉴定／药敏板的类别。

（3）若使用Accession条码，可用条码扫描器扫描，也可人工键入Accession号码。

（4）输入Isolate编号，仪器默认值为“1”。

（5）若使用单独的AST板，屏幕上必须输入细菌名称，否则仪器只报告MIC值，并且提示需要注意（Needs Attention）的板，在用户输入细菌菌名后，仪器的专家系统BDXpert才能解释MIC结果。

（6）存盘：当输入鉴定／药敏板信息后，必须在30分钟内将鉴定／药敏板放入仪器。

3.鉴定／药敏板的上机、孵育和取出按仪器屏幕旁的开锁键。等待屏幕上出现开门图标，打开仪器门，仪器停止转动，此时可将鉴定／药敏板放入仪器的空位置。仪器门锁由软件控制，在开锁图标未出现时，请勿强行开门。请勿人工转动孵育架。若仪器开门后，孵育架没有停止转动，请立即与BD联系。

检测完成后，按开门键，打开仪器门，取出检测完成的鉴定／药敏板。

4.报告的查询进入查询界面，输入Accession#（样本号）或Sequence#（序列号），可查询鉴定和药敏结果。

5.质控每批新批号鉴定／药敏板必须做QC。QC步骤：

（1）进入QC输入界面，分别输入或扫描Sequence#，Accession#。

（2）输入Isolate#，仪器默认值为“1”。

（3）选择ID和（或）AST。

（4）选择细菌名称。

（5）分别输入Tech ID，Panel Lot#，Panel Exp，ID Broth Lot#，1D Broth Exp，AST Broth Lot#，AST Broth Exp，AST Indicator Lot，AST Indicator Exp.

（6）存盘。

（7）将QC板放入仪器检测。

19.快速β内酰胺酶试验

【临床意义】

1.葡萄球菌 β内酰胺酶阳性，预示对青霉素、氨苄西林、羧苄西林、替卡西林耐药。

2.流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和卡他莫拉菌 β内酰胺酶阳性提示对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药。

【标本要求】

临床分离的葡萄球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和厌氧菌的纯菌落。

【方法与原理】

头孢硝噻吩纸片浸有色原底物头孢硝噻吩。当β内酰胺环中的氨键被β内酰胺酶水解时，此化合物可以出现快速的颜色反应，由黄变红。当细菌产生相当量的酶时，纸片上涂有菌落的区域将由黄变红。

局限性：此方法不适合检测快生长的革兰阴性菌产生的β内酰胺酶。

【材料】

镊子、接种环、载玻片。

【试剂】

头孢硝噻吩纸片（美国BBL公司）；或头孢硝噻吩试剂（英国Oxoid公司）。

【操作步骤】

用镊子将头孢硝噻吩纸片置于载玻片上，滴一滴无菌生理盐水浸湿纸片。用无菌接种环挑取数个相同的单个菌落涂在纸片表面。对于大多数菌，5分钟内观察颜色变化。厌氧菌需要30分钟，葡萄球菌需要1小时。

纸片颜色由黄变红为阳性，无变化为阴性。

20.超广谱β内酰胺酶（ESBL）检测

【临床意义】

ESBLs是质粒介导的能够水解三代头孢菌素和氨曲南的一种β内酰胺酶。携带ESBLs菌株的质粒不仅带有ESBL耐药基因，而且常常带有其他类的耐药基因，如氨基糖苷类、TMP/SMZ等，因此ESBLs阳性菌株多呈多重耐药。加之其由质粒介导，可以在病房引起广泛传播，甚至暴发流行，给治疗和感染控制带来困难。产ESBLs的菌株，一般可以选用：

1.碳青霉烯类，如亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、厄他培南。

2.β内酰胺类／酶抑制剂复合抗菌药物，如哌拉西林／三唑巴坦、头孢哌酮／舒巴坦等。

3.头霉素，如头孢美唑、头孢西丁。

根据药敏也可以用丁胺卡那、环丙沙星等。

【标本要求】

检测超广谱β内酰胺酶（ESBL）的细菌限制在临床分离的肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌。CLSI在2010年1月修改了头孢唑林、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑肟、头孢噻肟和氨曲南的药敏折点后，不必再对ESBL阳性菌株修改青霉素类、头孢菌素类和氨曲南药敏结果的解释，ESBL的检测仅用于流行病学分析或感染控制，并非常规药敏检测必需检测项目。

【方法与原理】

ESBLs能够水解三代头孢菌素，并且不同的ESBL亚型对不同的三代头孢菌素水解能力不同，而酶抑制剂克拉维酸可以抑制ESBLs。因此，可以利用头孢噻肟、头孢他啶及其与克拉维酸的复合制剂检测ESBLs，如果复合制剂对临床菌株的抑菌圈直径比单药的抑菌圈直径大≥5mm，或复合制剂对临床菌株的MIC比单药的MIC降低8倍以上即判定为ESBLs阳性。

局限性：ESBL的初步筛选和确证试验仅限于肠杆菌科的4个菌种。目前CLSI尚未给出肠杆菌科其他细菌及非发酵菌的ESBL检测系统。

【仪器】

普通孵育箱，纸片分配器。

【试剂】

头孢他啶（30μg／片）、头孢噻肟（30μg/片）、头孢泊肟（10μg/片）、氨曲南（30μg/片）、头孢噻肟（30μg/片）、头孢曲松（30μ/g/片）头孢他啶／克拉维酸（30μg／10μg／片）、头孢噻肟／克拉维酸（30μg／10μg／片）纸片（英国Oxoid公司）。头孢他啶、头孢噻肟、头孢泊肟、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松、克拉维酸干粉标准品购自中国药品生物制品检定所。

【操作步骤】

ESBL的初步筛选和表型确证试验分为纸片扩散法和MICs法，其操作的基本程序及结果的判定见表3-15、表3-16。

表3-15 肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形

杆菌中ESBLs检测的筛选和确证试验（纸片扩散法）

项目	初步筛选试验	表型确证试验
培养基抗菌药物浓度接种孵育条件孵育时间结果判读质控建议	MH琼脂头孢泊肟 10μg 或头孢他啶 30μg 或氨曲南 30μg 或头孢噻肟 30μg 或头孢曲松 30μg 或（使用一种以上的药物进行筛选将会提高检测的灵敏度）按标准纸片扩散法的规定进行 35℃；空气 16～20h 头孢泊肟抑菌圈≤17mm 头孢他啶抑菌圈≤22mm 氨曲南抑菌圈≤27mm 头孢噻肟抑菌圈≤27mm 头孢曲松抑菌圈≤25mm 一可疑有ESBL的产生肺炎克雷伯菌ATCC 700603或者大肠埃希菌ATCC 25922；肺炎克雷伯菌ATCC 700603: 头孢泊肟抑菌圈9～16mm 头孢他啶抑菌圈 10～18mm 氨曲南抑菌圈 9～17mm 头孢噻肟抑菌圈 17～25mm 头孢曲松抑菌圈 16～24mm	MH琼脂头孢他啶 30μg 头孢他啶／克拉维酸 30μg／10μg 和头孢噻肟 30μg 头孢噻肟／克拉维酸 30μg /10μg （确证试验需要同时使用头孢噻肟和头孢他啶，单独和联合克拉维酸复合制剂）按标准纸片扩散法的规定进行 35℃；空气 16～20h 任何一个药物与克拉维酸复合药的抑菌圈，比不加克拉维酸的单药的抑菌圈的差值≥5mm，判定为产ESBL（如头孢他啶的抑菌圈=16；头孢他啶／克拉维酸抑菌圈=21）肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大肠埃希菌ATCC 25922需常规检测；大肠埃希菌ATCC 25922:任何联合克拉维酸的复合制剂比单药抑菌圈增加≤2mm；肺炎克雷伯菌ATCC 700603:头孢他啶联合克拉维酸的复合制剂的抑菌圈增加≥5 mm；头孢噻肟联合克拉维酸的复合制剂的抑菌圈增加≥3mm

表3-16 肺炎克雷伯菌、产酸克雷菌、大肠杆菌和奇异变形杆菌中

ESBLs检测的筛选和确证试验（测MIC的肉汤稀释法）

项目	初步筛选试验	表型确证试验
培养基抗菌药物浓度接种孵育条件孵育时间结果判读质控建议	CAMHB* 头孢泊肟 4μg/ml或头孢他啶 1μg／ml或氨曲南 1μg/ml或头孢噻肟 1μg/ml或头孢曲松 1μg/ml或（使用一种以上的药物进行筛选将会提高检测的灵敏度）按标准肉汤稀释法的规定进行 35℃；空气 16～20h 生长=可疑有ESBL的产生（如对于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌，头孢泊肟≥8μg/ml，或头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、或头孢曲松MIC≥2μg/ml；对于奇异变形杆菌，头孢泊肟、头孢他啶、头孢噻肟MIC≥2μg／ml）大肠埃希菌ATCC 25922不长肺炎克雷伯菌ATCC 700603应当生长头孢泊肟MIC≥8μg／ml 头孢他啶MIC≥2μg／ml 氨曲南 MIC≥2μg/ml 头孢噻肟MIC≥2μg/ml 头孢曲松MIC≥2μg／ml	CAMHB 头孢他啶 0.25～128μg／ml 头孢他啶／克拉维酸 0.25/4～128/ 4μg／ml 和头孢噻肟0. 25～64μg/ml 头孢噻肟／克拉维酸 0. 25/4～64/ 4μg／ml （确证试验需要同时使用头孢噻肟和头孢他啶，单独和联合克拉维酸复合制剂）按标准肉汤稀释法的规定进行 35℃；空气 16～20h 若加克拉维酸后MIC比不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度，判定为产ESBL（如头孢他啶的 MIC= 8μg/ml，头孢他啶／克拉维酸的MIC为1μg/ml）大肠埃希菌ATCC 25922:联合克拉维酸的复合制剂的MIC，与单药的MIC相比，应当降低≤3个以上对倍稀释度肺炎克雷伯菌ATCC 700603:联合克拉维酸的复合制剂的MIC，与单药的MIC相比，应当降低≥3个以上对倍稀释度
*CAMHB：调节阳离子浓度的MH肉汤