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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验21-30
作者:王泓 日期:2014-06-19
【临床意义】
2010年6月美国临床与实验室标准化委员会（CLSI）修改了碳青霉烯类对肠杆菌科菌的药敏折点（CLSI M100-S20-U），使用新的折点后，碳青霉烯酶的检测可以不作为常规药敏试验的报告内容，但仍可用于流行病学或感染控制目的，改良霍奇试验（MHT）阳性结果不需要对药敏结果进行修改。
【标本要求】
对一种或多种碳青霉烯类抗菌药物中介或耐药（厄他培南不敏感是产碳青霉烯酶最敏感的指标），对一种或多种三代头孢菌素类（如头孢哌酮、头孢噻肟、头孢唑肟和头孢曲松）耐药的肠杆菌科菌。
【方法】
改良霍奇试验（MHT）。
【仪器】
35℃孵箱。
【试剂与材料】
10μg厄他培南纸片、10μg美罗培南纸片、大肠埃希菌ATCC 25922、MH琼脂培养基（MHA）。
【操作步骤】
1.接种物使用肉汤或生理盐水将大肠埃希菌ATCC 25922制备0.5 McF标准菌悬液，并做1: 10稀释。按照纸片扩散法药敏试验操作方法，将菌液密涂在MHA平板上，干燥3～10分钟。将10μg厄他培南纸片或10μg美罗培南纸片贴在平皿中心（图3-2和图3-3）。
2.接种 使用10μl接种环或棉拭子，挑取3～5个在血平板上过夜培养的待测菌或质控菌株菌落，沿纸片边缘向平皿边缘划直线接种，接种长度应至少达到20～25mm。直径90mm的MHA平板，可以贴1个纸片，接种包括阴、阳性质控株在内3个菌株；直径150mm的MHA平板，可以贴1～4个纸片，接种包括阴、阳性质控株在内的3～8个菌株（图3-2和图3-3）。
3.孵育 （35±2）℃，空气培养16～20小时。
4.判读 如图3-2和图3-3所示，孵育后，如果MHA平板上待测株或质控株与抑菌圈交叉的部分出现生长增强即为碳青霉烯酶阳性，没有增强现象即为碳青霉烯酶阴性。有些菌株会产生一些底物抵制大肠埃希菌ATCC 25922的生长，从而在接种线周围产生清晰的抑菌区（图3-4），MHT无法对这些菌株做出解释。
图3-2使用直径90mm MHA平板进行MHT
（1）肺炎克雷伯菌ATCCⓇ BAA-1705，结果阳性
（2）肺炎克雷伯菌ATCCⓇ BAA-1706，结果阴性
（3）临床分离株，结果阳性
图3-3 使用直径150mm MHA平板和厄他培南纸片进行MHT
1.肺炎克雷伯菌ATCCⓇBAA-1705，结果阳性
2.肺炎克雷伯菌ATCCⓇ BAA-1706，结果阴性
3～8 临床分离株 6号菌为阴性结果
3、4、5、7、8号菌为阳性结果
5.报告对于MHT阳性的菌株，应检测菌株对碳青霉烯类的MIC值，药敏结果的解释仅依据菌株的MIC，不受MHT结果影响。
图3-4结果解释
（1）MHT无法解释的临床分离株；（2）MHT阴性临床分离株
6.局限性 MHT对KPC型碳青霉烯酶有很好的敏感性（＞90%）和特异性（＞90%），但对低水平表达的金属β内酰胺酶的敏感性和特异性尚不确定。尚无数据表明对非发酵革兰阴性杆菌使用MHT检测碳青霉烯酶的作用。
【质控】
每次检测均应同时进行阳性和阴性质控。
1.阳性质控株 肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705，或本实验室保存的经分子生物学和MHT检测，确认产碳青霉烯酶的菌株。
2.阴性质控株 肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706，或本实验室保存的经分子生物学和MHT检测，确认不产碳青霉烯酶的菌株。
【临床意义】
耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）包括金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）也被称为耐苯唑西林金黄色葡萄球菌（oxacillin-resistant staphylococcus aureus，ORSA），已成为世界范围内主要的医院感染病原菌。
必须注意，MRS对所有β内酰胺类，包括青霉素类、头孢菌素类、β内酰胺/β内酰胺酶抑制剂类和碳青霉烯类，可在体外显示活性但临床无效，因此对上述药物应报告为“耐药”。
青霉素耐药的葡萄球菌产β内酰胺酶，青霉素的敏感性可用于预测所有青霉素酶稳定的青霉素类药物的敏感性，如氨苄西林、阿莫西林、阿洛西林、羧苄西林、美洛西林、哌拉西林和替卡西林。对于青霉素MIC≤0.12μg／ml或抑菌圈直径≥29mm的金黄色葡萄球菌，应检测其诱导性B内酰胺酶。
因此，葡萄球菌对β内酰胺类药物的敏感性，可由青霉素、苯唑西林和头孢西丁的敏感性推知。
【仪器】
35℃孵箱、游标卡尺。
【试剂】
30μg头孢西丁纸片、1μg苯唑西林纸片、MH琼脂培养基（MHA）。
【操作步骤】
1.纸片扩散法
（1）使用直接菌落悬滴法制备0.5麦氏单位菌液，接种MHA平板。
（2）贴30μg头孢西丁纸片、1μg苯唑西林纸片，35℃孵育24小时（35℃以上可能无法检出MRS）。
（3）检查并判断抑菌圈直径，如出现明显的圈内菌落或圈内生长的菌膜应判断为耐药。抑菌圈直径的判断应该采用CLSI的标准，见表3-17。
表3-17 纸片扩散法检测葡萄球菌中mecA基因介导的耐药
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抗菌药物（纸片含量）
|
菌株
|
抑菌圈直径（mm）
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备注
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|
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S
|
R
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|||
|
苯唑西林
（1μg）
|
金黄色葡萄球菌
|
≥13
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≤10
|
1.对于金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌，如果头孢西丁和苯唑西林任一药物耐药，即报告为MRS
2.对于一些凝固酶阴性葡萄球菌，苯唑西林可能过度评价其耐药性，因为一些苯唑西林MICs0.5～2μg／ml的非表皮葡萄球菌不具有mecA基因
|
|
路登葡萄球菌
|
NA
|
NA
|
||
|
凝固酶阴性葡萄球菌
|
||||
|
头孢西丁
（30μg）
|
金黄色葡萄球菌
|
≥22
|
≤21
|
|
|
路登葡萄球菌
|
||||
|
凝固酶阴性葡萄球菌（除路登葡萄球菌）
|
≥25
|
≤24
|
||
（4）注意事项：对于金黄色葡萄球菌，头孢西丁纸片试验和苯唑西林纸片试验在检测mecA介导的苯唑西林耐药上是有相似的灵敏度和特异性的，然而，头孢西丁纸片试验更容易判读结果。对于路登葡萄球菌，只有头孢西丁纸片试验应予采用。因此，头孢西丁可以作为报告苯唑西林的替代药物，苯唑西林的敏感性可基于头孢西丁的结果报告。
对于凝固酶阴性葡萄球菌，头孢西丁纸片试验是更好的方法。尽管对于表皮葡萄球菌来说苯唑西林的解释标准与mecA的符合性很好，但这些解释标准可能会过高地估计其他凝固酶阴性葡萄球菌的耐药性（如腐生葡萄球菌）。对于凝固酶阴性葡萄球菌，头孢西丁纸片试验比苯唑西林纸片试验有更高的特异度和相等的灵敏度。因此，头孢西丁可以作为报告苯唑西林的替代药物，苯唑西林的敏感性可基于头孢西丁的结果报告。
对于所有的葡萄球菌，用透射光观察苯唑西林抑菌圈内是否有微弱生长，抑菌圈内任何可观察到的菌落生长提示苯唑西林耐药。头孢西丁纸片试验则应使用反射光读取结果。
2.微量肉汤稀释法和琼脂稀释法
（1）使用接种物直接制备菌液。
（2）用苯唑西林检测，能有效地检测出葡萄球菌对其他耐酶青霉素的交叉耐药性。
（3）肉汤稀释法使用阳离子调节并含有2%NaCl的MH肉汤（CAMHB+2%NaCl），琼脂稀释法使用含有2%NaCl的MH琼脂（MHA+2%NaCl）。
（4）35℃孵育24小时，判断标准应该采用CLSI标准（表3-18），孵育温度高于35℃可能漏检MRS。
表3-18 MIC法检测葡萄球菌中mecA基因介导的耐药
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抗菌药物（纸片含量）
|
菌株
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MIC（μg/ml）
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备注
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|
|
S
|
R
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|||
|
苯唑西林
|
金黄色葡萄球菌
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≤2
|
≥4
|
1.对于金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌，如果头孢西丁和苯唑西林任一药物耐药，即报告为MRS
2.对于一些凝固酶阴性葡萄球菌，苯唑西林可能过度评价其耐药性，因为一些苯唑西林MICs0.5～2μg／ml的非表皮葡萄球菌不具有mecA基因
|
|
路登葡萄球菌
|
≤0.25
|
≥0.5
|
||
|
凝固酶阴性葡萄球菌
|
||||
|
头孢西丁
|
金黄色葡萄球菌
|
≤4
|
≥8
|
|
|
路登葡萄球菌
|
||||
|
凝固酶阴性葡萄球菌（除路登葡萄球菌）
|
NA
|
NA
|
||
（5）注意事项：在耐酶青霉素中，苯唑西林的结果可以解释其他耐酶青霉素，优先选用苯唑西林，因为该药不易降解且更易检出异质性耐药的菌株。对表皮葡萄球菌来说，现行的凝固酶阴性葡萄球菌解释标准和mecA基因符合性很好，但在其他葡萄球菌中（如腐生葡萄球菌），此标准可能会过高地估计耐药性，因此对于表皮葡萄球菌以外的其他凝固酶阴性葡萄球菌引起的严重感染，当菌株对苯唑西林的MIC为0.5～2μg/ml，最好应检测mecA或PBP2a是否存在。
对于金黄色葡萄球菌而言，头孢西丁纸片扩散法和MIC法有相同的灵敏度和特异度，对于凝固酶阴性葡萄球菌，头孢西丁纸片扩散法与苯唑西林MIC法相比有相同的灵敏度和更高的特异度（即：在鉴别苯唑西林敏感的菌株时，头孢西丁纸片试验比苯唑西林MIC试验更准确）。
葡萄球菌对苯唑西林耐药的一个重要线索是该菌株对其他β内酰胺类抗菌药物如红霉素、克林霉素、氨基糖苷类、四环素和氯霉素等抗菌药物在体外表现出多重耐药性。尽管MRSA菌株肯定对β内酰胺类抗菌药物耐药，但在体外试验中对其他抗菌药物的耐药性则是多种多样的。
3.结果报告 MRS（包括MRSA和MRSCN）无论体外试验的结果敏感与否，均应报告对所有β内酰胺类抗菌药物（包括青霉素类、头孢菌素和亚胺培南）耐药，因为大多数MRS感染者临床上对上述抗菌药物没有反应。而且MRS通常同时对氨基糖苷类、大环内酯类、克林霉素和四环素多重耐药，在报告中必须加以提示。
MRS轻度感染可选用利福平、复方磺胺甲■唑和环丙沙星等治疗，对严重的全身感染只能选用万古霉素、替考拉宁或利奈唑胺。
【临床意义】
日本（1997年）首先报告金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感性降低（MIC为4～8μg／ml），之后美国和法国也相继报告，其耐药机制涉及细胞壁增厚和PBPs亲和力的改变。该现象往往在MRSA中出现，如果MRSA对万古霉素的疗效不好，应考虑为万古霉素中介的金黄色葡萄球菌（VISA）或万古霉素异质性耐药的金黄色葡萄球菌（hVISA）。纸片扩散试验不能区分对万古霉素敏感（MIC≤2μg/ml）以及敏感性下降（MIC为4～8μg/ml）的菌株。须仔细检测MRSA对万古霉素的MIC。
【方法与原理】
VISA/VRSA的检测标准参考方法是微量肉汤稀释法。可使用含6μg／ml万古霉素的脑心浸液（BHI）琼脂培养基进行筛选，以提高检测的灵敏度。
【仪器】
35℃孵箱。
【试剂】
含6μg／ml万古霉素的BHI培养基。
【操作步骤】
1.制备菌落悬液0.5麦氏浓度，用移液器加10μl菌液于琼脂表面；或用无菌棉签蘸取菌液，拧干多余菌液后，涂布成10～15mm直径的菌斑，或在平皿上划线接种。
2. 35℃，空气培养，24小时。
3.用透射光仔细检查有＞1个菌落生长或轻微的菌膜生成，为可疑的敏感性降低。使用认可的方法测定万古霉素的MIC值来确证敏感性降低。
4.如出现对万古霉素敏感性下降的菌株（MIC≥4μg／ml），应该送参考实验室确认。
5.局限性这种方法不能检出所有对万古霉素中介的菌株，部分菌株对万古霉素MIC=4μg／ml在此筛选平皿上不能生长。
【质控】
1.阴性质控株 粪肠球菌ATCC 29212。
2.阳性质控株 粪肠球菌ATCC 51299。
【临床意义】
大环内酯类耐药的葡萄球菌可以体现出对克林霉素的结构型或诱导型耐药，即由erm基因介导的23S rRNA甲基化，也称为大环内酯-林可霉素-链阳霉素B（MLSB）耐药；或仅对大环内酯类耐药（由msrA基因介导的外排泵机制）。
大环内酯类耐药的β溶血链球菌可以体现出对克林霉素的结构型或诱导型耐药，即由erm基因介导的23S rRNA甲基化，也称为大环内酯-林可霉素-链阳霉素B（MLSB）耐药；或仅对大环内酯类耐药（由mef基因介导的外排泵机制）。
【标本要求】
1.对红霉素耐药，而对克林霉素敏感或中介的金黄色葡萄球菌、路登葡萄球菌。
2.红霉素耐药，而对克林霉素敏感或中介的β溶血链球菌。
【仪器】
35℃孵箱。
【试剂】
15μg红霉素纸片、2μg克林霉素纸片、MH琼脂培养基（MHA）、含5%羊血的MHA。
【操作步骤】
1.葡萄球菌
（1）按照标准的纸片扩散法程序，使用MHA，在15μg红霉素纸片周围贴2μg克林霉素纸片，两纸片的边缘相距15～26mm。
（2）（35±2）℃孵育16～18小时后，若克林霉素纸片抑菌圈靠近红霉素一侧出现切割现象（D形抑菌圈），为克林霉素诱导性耐药。
（3）若克林霉素抑菌圈内出现模糊的生长，无论是否出现D现象，均为克林霉素耐药。
（4）应向临床报告为“克林霉素耐药”，另外报告中还应附上以下内容：“该菌株可被诱导对克林霉素耐药。但在某些患者使用克林霉素可能仍然有效。”
2.β溶血链球菌
（1）按照标准的纸片扩散法程序，使用含5%羊血的MHA，在15μg红霉素纸片周围贴2μg克林霉素纸片，两纸片的边缘相距12mm。
（2）（35±2）℃在5%CP2环境孵育20～24小时后，若克林霉素纸片抑菌圈靠近红霉素一侧出现切割现象（D形抑菌圈），为克林霉素诱导性耐药。
（3）若克林霉素抑菌圈内出现模糊的生长，无论是否出现D现象，均应为克林霉素耐药。
（4）应向临床报告为“克林霉素耐药”，另外，报告中还应附上以下内容：“该菌株可被诱导对克林霉素耐药。但在某些患者使用克林霉素可能仍然有效。”
【临床意义】
青霉素、氨苄西林和万古霉素在体外试验或单独使用时，肠球菌常常表现出顽强耐药性，但如果将万古霉素、青霉素与氨基糖苷类抗菌药物联合使用可表现出协同作用，可在体外试验中表现出杀菌的活性。这种协同杀菌活性被认为是由青霉素和万古霉素破坏了细菌的细胞壁，而有助于氨基糖苷类抗菌药物的渗入和吸收。因此，联合使用抗菌药物的疗法是治疗严重的肠球菌感染（菌血症、心内膜炎、脑膜炎和骨髓炎）的标准疗法。
HLAR筛选试验，耐药（R）表示对作用于细胞壁的抗菌药物（即氨苄西林、青霉素和万古霉素）无协同作用；敏感（S）表示对作用于细胞壁的抗菌药物有协同敏感作用。
【方法与原理】
肠球菌对氨基糖苷类高水平耐药（HLAR），由［APH（2”）-AAC（6’）］等氨基糖苷类钝化酶所致。可使用改良琼脂稀释法、肉汤微量稀释法或琼脂纸片扩散法进行检测。
【仪器】
35℃孵箱。
【试剂】
120μg庆大霉素纸片、300μg链霉素纸片、MH琼脂培养基（MHA）、脑心浸液（BHI）培养基。
【操作步骤】
1.纸片扩散法（表3-19）
表3-19 高水平氨基糖苷类药物耐药（HLAR）的纸片扩散法筛选试验
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试验／报告组
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抗菌药物
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纸片含量
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抑菌圈直径（mm）
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对应的MIC折点
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备注
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R
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I
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S
|
R
|
S
|
||||
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C
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庆大霉素（HLAR）
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120μg
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6
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7～9
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≥10
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＞500μg／ml
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≤500μg／ml
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假如抑菌圈直径为7～9mm，则结果是非确定的，此时需要进行琼脂稀释法或微量肉汤稀释法筛选试验以确定是否耐药
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|
C
|
链霉素（HLAR）
|
300μg
|
6
|
7～9
|
≥10
|
肉汤法＞1000μg／ml
琼脂法＞2000μg/ml
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肉汤法≤500μg/ml
琼脂法≤1000μg／ml
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对于微量肉汤稀释法，链霉素MIC＞1000μg/ml为耐药，琼脂稀释法则MIC＞2000μg／ml为耐药
|
注：对于HLAR筛选试验，可用粪肠球菌ATCC29212（敏感株）作为质控。
耐药：不能与作用于细胞壁的抗菌药物（如氨苄西林、青霉索、万古霉素）发生协同作用
非确定（Ⅰ）：进行琼脂稀释法或微量肉汤稀释法进行确证
敏感：可与作用于细胞壁且敏感的抗菌药物（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）发生协同作用
2.稀释法（表3-20）
表3-20 高水平氨基糖苷类药物耐药（HLAR）的稀释法筛选试验
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筛选试验
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庆大霉素HLAR
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链霉素HLAR
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培养基
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BHI肉汤或琼脂
|
BHI肉汤或琼脂
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抗菌药物浓度
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500μg／ml
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肉汤：1000μg/ml
琼脂：2000μg/ml
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接种物
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用生长法或直接菌落悬滴法调成0.5麦氏浊度菌液
琼脂法：10μl0.5麦氏浊度菌液点种于琼脂表面
肉汤法：标准肉汤稀释操作
|
用生长法或直接菌落悬滴法调成0.5麦氏浊度菌液
琼脂法：10μl0.5麦氏浊度菌液点种于琼脂表面
肉汤法：标准肉汤稀释操作
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孵育条件
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35℃，空气培养
|
35℃，空气培养
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孵育时间
|
24小时
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24～48小时（若24小时后敏感则继续孵育）
|
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结果
|
琼脂法：＞1个菌落为耐药
肉汤法：任何生长为耐药
耐药——不能与作用于细胞壁
的抗菌药物（如氨苄西林、青霉
素、万古霉素）发生协同作用
敏感——可与作用于细胞壁且
敏感的抗菌药物（如氨苄西林、
青霉素、万古霉素）发生协同作用
|
琼脂法：＞1个菌落为耐药
肉汤法：任何生长为耐药
耐药——不能与作用于细胞壁的抗
菌药物（如氨苄西林、青霉素、万古
霉素）发生协同作用
敏感——可与作用于细胞壁且敏感
的抗菌药物（如氨苄西林、青霉素、
万古霉素）发生协同作用
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质控
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粪肠球菌ATCC29212——敏感
粪肠球菌ATCC51299——耐药
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粪肠球菌ATCC29212——敏感
粪肠球菌ATCC51299——耐药
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【临床意义】
肠球菌对万古霉素的耐药可分为低水平耐药（MIC为8～32mg/L）和高水平耐药（MIC为≥64mg/L）。根据肠球菌对万古霉素和替考拉宁的不同耐药水平及耐药基因，VRE分为5个表型，分别是VanA、VanB、VanC、VanD和VanE（表3-21）。
VanA、VanB、VanD均为获得性耐药：VanA对万古霉素和替考拉宁均呈高水平耐药；VanB对万古霉素低水平耐药，对替考拉宁敏感；VanD对万古霉素耐药，对替考拉宁敏感。VanC为天然耐药，对万古霉素为低水平耐药。VanE为获得性耐药。
治疗VRE的可选药物有限，氯霉素、红霉素、四环素（或多西环素、米诺环素）和利福平可用于治疗VRE感染，同时应与感染性疾病专家咨询。
表3-21 VRE的分型及其耐药表型
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类型
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万古霉素（μg/ml）
|
替考拉宁（μg/ml）
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VanA
VanB
VanC
VanD
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64～1000以上
4～1024
2～32
16～64
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16～512
0.25～2
0.12～2
2～4
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【方法与原理】
VRE的检测系统：可用稀释法、纸片扩散法、Etest和自动化仪器。在检测VanA、VanB、VanCl/C2时，Etest和琼脂筛选法最佳，敏感率为100%。纸片扩散法检测VanB型的敏感率为93%，VanCl为52%，VanC2为63%。应用自动化仪器检测VRE，VITEK GPS-101检测VanB型的敏感率为100%。Mi-croScan传统法因检测时间比快速法长，所以检测VanB型的敏感率为100%，而快速法只有53%。
【仪器】
35℃孵箱、20μl移液器。
【试剂】
含6μg/ml万古霉素的脑心浸液（BHI）琼脂培养基。
【操作步骤】
1.检测VRE时，应孵育满24小时。
2.对于MICs在8～16μg/ml的肠球菌，应进行生化鉴定，将鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌从中区分出来。
3.使用纸片法检测，应采用透射光检测，任何模糊的生长或抑菌圈内的生长，应报告为耐药。
4.纸片扩散法检测为万古霉素中介的肠球菌，应采用MIC法进行确认，方法见表3-22:
表3-22 琼脂稀释法VRE筛选试验
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培养基
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BHI琼脂
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抗菌药物浓度
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万古霉素6μg／ml
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接种物
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用生长法或直接菌落悬滴法调成0.5麦氏浊度菌液
1～10μl 0.5麦氏浊度菌液点种于琼脂表面
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孵育条件
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35℃，空气培养
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孵育时间
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24小时
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结果
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＞1个菌落为可疑耐药
测定万古霉素的MIC值并检测菌株的动力和色素以将获得性耐药菌株（VanA和VanB）和天然的、中介水平耐药菌株（VanC）如醇鸡肠球菌和铅黄肠球菌区分，这两种菌也能在万古霉素筛选平皿上生长。从感染控制的角度，应将万古霉素MICs在8～16μg／ml的醇鸡肠球菌和铅黄肠球菌与VRE区分。
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质控
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粪肠球菌ATCC29212——敏感
粪肠球菌ATCC51299——耐药
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【临床意义】
1.非脑膜炎分离的肺炎链球菌 青霉素MICs≤0.06 μg／ml或苯唑西林纸片抑菌圈直径≥20mm，可以预测菌株对氨苄西林（口服或静脉）、氨苄西林-舒巴坦、头孢克洛、头孢地尼、头孢托仑、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢唑肟、头孢呋辛、亚胺培南和美罗培南敏感；青霉素MICs≤2μg／ml可以预菌株对阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松和厄他培南敏感。
肺炎链球菌对苯唑西林抑菌圈直径≥20mm，代表对青霉素敏感（≤0. 06μg/ml）。如果苯唑西林抑菌圈直径≤19mm，意味着菌株对青霉素耐药或中介，应测定其对青霉素、头孢噻肟、头孢曲松或美罗培南的MICs，但如果没有进行青霉素MIC检测，不得报告青霉素耐药。
由青霉素MICs≤2μg／ml的肺炎链球菌引起的非脑膜炎感染，对于肾功能正常的成人，可以每4小时至少静脉给药2 000 000单位青霉素。由对青霉素中介的肺炎链球菌（MIC= 4μg/ml），每天至少静脉给药18 000 000～24 000 000单位青霉素。
对于分离自非脑脊液标本的肺炎链球菌，应同时根据脑膜炎和非脑膜炎折点报告药敏结果。
2.脑膜炎分离的肺炎链球菌对于分离自脑脊液的肺炎链球菌，应检测青霉素、头孢噻肟、头孢曲松或美罗培南的MIC，还应使用MIC法或纸片扩散法检测其对万古霉素的敏感性。对于脑脊液分离株，仅根据脑膜炎折点报告药敏结果。
临床应使用青霉素最大静脉剂量进行治疗，对于肾功能正常的成年患者，应每4小时至少给药3 000 000单位。
【方法】
肺炎链球菌感染经常采用阿莫西林、氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛、厄他培南、亚胺培南和美罗培南进行治疗，但纸片扩散法不能准确地检测这些药物的敏感性，应采用MIC法进行检测。
【仪器】
35℃孵箱。
【试剂】
5%羊血的MH琼脂（MHA）、2.5%～5% LHB的阳离子调节MH肉汤（CAMHB）、20μg苯唑西林纸片。
【操作步骤】
1.采用菌落直接悬液（DCS）法 从培养过夜（16～18小时）的羊血琼脂（SBA）平板上选取数个菌落，用MH肉汤或生理盐水制备悬液，调节浊度至0.5麦氏度浓度。
2.采用纸片扩散法或稀释法，进行检测。
3.（35±2）℃，纸片扩散法5% CO2环境孵育20～24小时，稀释法空气培养20～24小时。
4.纸片扩散法，苯唑西林抑菌圈直径≥20mm，代表对青霉素敏感；如果苯唑西林抑菌圈直径≤19mm，意味着菌株对青霉素耐药或中介，应测定其对青霉素、头孢噻肟、头孢曲松或美罗培南的MICs，但如果没有进行青霉素MIC检测，不得报告青霉素耐药。 5.对于青霉素、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松，脑膜炎和非脑膜炎患者，应采用不同折点进行报告，见表3-23:
表3-23 肺炎链球菌对β内酰胺类药物脑膜炎和非脑膜炎折点
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抗菌药物
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纸片法折
点（mm）
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MIC法折点（μg／ml）
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备注
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||
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S
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I
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R
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|||
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苯唑西林（1μg）
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≥20
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—
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—
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—
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肺炎链球菌对苯唑西林抑菌圈直径≥20mm，代表对青霉素敏感（≤0.06μg/ml）。如果苯唑西林抑菌圈直径≤19mm，意味着菌株对青霉素耐药或中介，应测定其对青霉素、头孢噻肟、头孢曲松或美罗培南的MICs，但如果没有进行青霉素MIC检测，不得报告青霉素耐药
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|
青霉素静脉（非脑膜炎）
|
—
|
≤2
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4
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≥8
|
对于分离自非脑脊液标本的肺炎链球菌，应同时根据脑膜炎和非脑膜炎折点报告药敏结果
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|
阿莫西林（非脑膜炎）
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—
|
≤2
|
4
|
≥8
|
|
|
阿莫西林-克拉维酸（非脑膜炎）
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—
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≤2／1
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4/2
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≥8/4
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|
|
头孢吡肟（非脑膜炎）
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—
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≤1
|
2
|
≥4
|
|
|
头孢噻肟头孢曲松（非脑膜炎）
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—
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≤1
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2
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≥4
|
|
|
青霉素静脉（脑膜炎）
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—
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≤0.06
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—
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≥0.12
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对于脑脊液分离株，仅根据脑膜炎折点报告药敏结果
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青霉素（口服青霉素V）
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—
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≤0.06
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0.12～1
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≥2
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头孢吡肟（脑膜炎）
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—
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≤0.5
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1
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≥2
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头孢噻肟头孢曲松（脑膜炎）
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—
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≤0.5
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1
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≥2
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头孢呋辛（静脉）
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—
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≤0.5
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1
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≥2
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头孢呋辛（口服）
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—
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≤1
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2
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≥4
|
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【临床意义】
根据不同部位分离的真菌的种类和数量并结合临床而定。
【标本要求】
1.深部真菌标本包括无菌体液、脓、分泌物等均应在无菌条件下收集标本，并立即送检，2小时内处理完毕。否则应立即放入冰箱或冷藏运送，一般不超过8小时。
2.无菌体液关节液标本≤5ml，胸腹水可送20ml，做培养或镜检。
3.血标本取静脉血8～10ml，立即打入血培养瓶。如不能立即送检，培养瓶应在室温保存。
4.尿标本清洁外阴后，取清洁中段尿至少5ml；或行膀胱穿刺术采集尿标本。取材后立即送检，2～8℃保存不应长于12小时。
5.脑脊液取至少2ml，置无菌密封小瓶内，立即送检，不冷藏。
6.呼吸道标本包括痰、支气管肺泡灌洗液（BALF）、咽拭子、支气管抽吸液、气管吸出液、气切管分泌物等。痰标本以清晨痰液为好，采集前先刷牙或漱口，有义齿者先取出，用漱口液及刷子清洗口腔，再深咳嗽采集痰液标本。
7.组织标本将组织标本置于无菌研磨器内研磨后，再行各种检查，如临床怀疑接合菌纲真菌感染，应将组织标本使用无菌剪刀剪碎后，再进行培养。
【仪器及材料】
28℃孵箱、37℃孵箱、API 20C试剂盒、VITEK 2 YST鉴定卡、光学显微镜、离心机、电子灭菌器、镊子、消毒研磨器、载玻片、盖玻片、剪刀、固体石蜡。
【试剂和培养基】
沙保弱琼脂（Sabouraud agar）平皿（SDA）、沙保弱琼脂斜面、土豆培养基（Potato agar，PDA）、脑心浸液培基（BHI）。科玛嘉显色培养基（CHROM agar，郑州博赛公司），乳酸酚棉蓝。
【操作步骤】
1.接种标本前超净工作台先进行紫外线照射15分钟，每天用75%酒精擦拭台面。超净工作台要定期做质控，质控合格方可进行常规工作。
2.不同标本处理程序
（1）呼吸道标本：用无菌棉签挑取标本，涂片，紫外线照射30分钟，15%KOH压片。划线接种加氯霉素沙保弱琼脂斜面，28℃孵育，每48小时观察一次生长情况，如培养阳性，鉴定酵母菌和丝状真菌，结合临床诊断及医嘱做药敏试验并留菌；如培养阴性，继续培养至第7天发阴性报告，如临床有特殊要求，可延长培养至14～30天。
由于临床上很多患者存在呼吸道念珠菌定植，因此对于分离自呼吸道标本的念珠菌仅在以下情况进行药敏试验：
1）分离自BALF，且菌量≥103 cfu/ml的念珠菌。
2）检验申请单上临床诊断标明为“肺部感染”、“肺炎”、“肺部阴影”等，且菌量在“+++”以上的念珠菌。
3）分离自ICU、血液科、免疫科和肿瘤科等科室的重症、易接受激素治疗、免疫损伤的患者，且菌量在“+++”以上的念珠菌。
4）菌量在“++++”以上的念珠菌。
5）呼吸道标本涂片，可见大量酵母样孢子或假菌丝的标本，培养所得念珠菌。
6）临床或患者特殊要求进行药敏试验者。
对于分离自呼吸道的丝状真菌，如仅有1～2个菌落生长，且生长在沙保弱琼脂斜面的上半部分，应与临床进行沟通，根据患者是否有呼吸道感染的临床症状和体征，以及临床医生的要求，决定是否进行药敏试验，并建议复查。如难以与临床或患者取得联系，暂不做药敏试验，向临床报告菌名及菌落数，并在报告中注明“建议复查”。
（2）生殖道标本：用无菌棉签，涂片，紫外线照射30分钟，15 %KOH压片。接种标本到加氯霉素的沙保弱琼脂斜面，28℃孵育，每48小时观察一次生长情况，如培养阳性，鉴定酵母菌和丝状真菌，除临床特别要求，一般不需要做药敏试验；如培养阴性，继续培养至7天发阴性报告。
（3）无菌标本（胸腹水、引流液、关节液、CSF等）：对于质地清亮的标本，应使用甩片机进行甩片，浑浊或血性标本，直接使用无菌吸管将2～3滴标本滴于载玻片上，均匀涂开后晾干，紫外线照射30分钟，15%KOH压片。用无菌吸管吸取少量标本，接种到加氯霉素沙保弱琼脂斜面底部，使用无菌接种环沿斜面自底部划线至顶部，28℃孵育，48小时观察一次生长情况，如培养阳性，鉴定酵母菌和丝状真菌，做药敏试验并留菌；如48小时培养阴性，继续培养至7天，发阴性报告，脑脊液标本培养至14天，每2～3天观察一次。
（4）组织标本：使用无菌研磨器研磨标本，如临床怀疑患者为接合菌纲真菌感染，应使用无菌剪刀将标本剪碎，不可研磨。将处理后标本，滴于载玻片上，均匀涂开后，紫外线照射30分钟，六胺银染色或15 %KOH压片镜检。将标本点种于加氯霉素的沙保弱平皿，点种3个点，用封口膜将平皿封口后，放入28℃孵箱孵育，每2～3天观察一次生长情况，如培养阳性，鉴定酵母菌和丝状真菌，做药敏并留菌；培养至14天发阴性报告，培养基继续培养至30天，如阴性不再发阴性报告，如延长培养有真菌生长，进行鉴定及药敏试验，与临床电话沟通并补发报告。
3.鉴定
（1）酵母样真菌：转种显色培养基，分区划线，37℃孵育24～48小时观察菌落形态和颜色，绿～翠绿色为白念珠菌，紫色为光滑念珠菌，蓝灰～铁蓝色为热带念珠菌，粉色为克柔念珠菌，通常应以48小时培养显色结果为准，尤其是热带念珠菌和光滑念珠菌。对于显色培养基不能鉴定的菌种（约15%），使用API20C或VITEK 2 YST卡鉴定，特殊菌种加做相关补充试验。
（2）丝状真菌鉴定：根据生长速度、菌落大小、菌落质地、表面是凸起还是凹陷、菌落的颜色和扩散色素、菌落表明是否有渗出物及特殊气味、气生菌丝及琼脂内菌丝特点、乳酸酚棉蓝染色镜检下形态、小培养镜下形态，结合不同培养基上不同生长阶段的镜下结构、生化反应谱鉴定出真菌属种。
4.报告方式
（1）真菌15%KOH压片
1）若显微镜下未见真菌，则报告“涂片镜检未找到菌丝和孢子”。
2）若显微镜下找到真菌，则报告真菌的数量（大量、较多、少量、偶见）、孢子（是否酵母样孢子）和菌丝形态（假菌丝、有隔真菌丝、无隔真菌丝、飘带样、宽大、分枝角度等）。
（2）真菌培养
1）若培养有真菌生长，则报告真菌的中英文名，菌的数量（+、++、+++、++++）以及菌株的药敏结果。
2）若培养无真菌生长，则报告“经鉴定无真菌生长”。
【临床意义】
镜检看到痰液中的卡氏肺孢子菌体包囊壁呈黑色，因包囊壁薄厚不均，染色深浅不一，可呈括号样或中心点状深染。临床可诊断肺孢子菌肺炎。涂片中看到染成深棕黑色的真菌菌体可根据真菌形态学特点作初步分类，是念珠菌、曲霉菌、毛霉菌等。尤其是在无菌体液中检出真菌，作初步分类鉴定，可为临床早期治疗提供依据。
【标本要求】
1.呼吸道标本
（1）诱导痰或气管吸痰（患者清晨咳深部痰切勿唾液，送检）。消化（加等量的Sputasol消化液，室温消化15分钟）后离心（3000g×5min），取沉淀涂片甲醇固定。自然风干后染色镜检。
（2）毛刷直接涂片，自然风干后染色镜检。
（3）BALF:20～30ml，3000g×15min，取沉淀涂片甲醇固定。如果标本量有限可用Cytospin甩片机离心。涂片、自然风干后染色镜检。
2.脑脊液及其他无菌体液 用无菌手续3000rpm×5min离心后涂片甲醇固定。
3.肺组织穿刺标本。研磨后涂片甲醇固定。
4.已脱蜡置水的甲醇固定的组织学切片。
【原理】
真菌的细胞壁富含多糖，经过碘酸氧化后释出醛基，直接将硝酸银还原成金属银，而使真菌细胞或肺孢菌染成棕黑色，使真菌轮廓更清楚。从而与浅绿色背景形成反差而易于辨认。区别于被检标本的纤维。
【仪器】
普通光学显微镜。
65℃孵箱或水浴箱。
【试剂】
1.1%过碘酸水溶液（periodic acid）避光保存，制备好4℃保存1个月。 2.银溶液配制（methenamine silver nitrate solution）：现用现配，用后弃去。
5%硝酸银水溶液（silver nitrate） 4ml
保存：避光保存，制备好4℃保存1个月。
3%乌洛托品水溶液（methenamine） 32ml
保存：制备好4℃保存1个月。
2%硼酸水溶液（borax） 4ml
保存：制备好4℃保存1个月。
3.0. 25%的氯化金水溶液（gold chloride），4℃保存1个月。
4. 3%的硫代硫酸钠水溶液（sodium thiosulfate），室温保存1年。
5.0.1%的亮绿水溶液（light green），室温保存1年。
【操作步骤】
1.染色
（1）玻片处理：甲醇固定后，自然风干。
（2）1%过碘酸滴染10分钟。溶液用后弃去。
（3）流水冲洗。
（4）65℃银溶液染1～1.5小时。染色时间根据涂片的厚度，所怀疑真菌的种类。通常念珠菌染色1小时即可。疑为曲霉或其他丝状真菌须适当延长染色时间（银溶液需现用现配，只用一次）。
（5）流水冲洗。
（6）0.25%的氯化金染1～2分钟。
（7）流水冲洗。
（8）3%的硫代硫酸钠染1分钟。
（9）流水冲洗。
（10）0.1%的亮绿染色30秒到1分钟，目的是为得到一个背景色。
2.注意事项经常检查以保证染色时间适当，以免过深或过浅。过深：尤其在检查肺孢子菌（Pneumocystis）时，肺泡中的红细胞也可为新月形，染黑后极似肺孢子菌的包囊。过浅：会漏诊。
3.结果报告
（1）痰液涂片镜检中看到菌体包囊壁呈黑色，呈括号样或中心点状深染的形态。报告：涂片找到卡氏肺孢菌（Pneumocystis）。
（2）涂片找到染色成黑棕色的孢子或菌丝体，根据形态特点加以辨别。
4.质量控制
（1）每次染色同时染一张阳性涂片。 （2）阳性涂片用ATCC90028白念珠菌制备菌悬液后制成涂片。晾干后备用。根据阳性涂片着色的深浅调整染色时间。
【标本要求】
脑脊液、痰等标本。
【原理】
在菌细胞周围存在黏多糖荚膜物，应用墨汁湿片法能证明荚膜的存在，新型隐球菌的荚膜取代了墨汁中的胶状碳粒，呈现清楚无色透明的晕圈环绕着菌体。
【仪器】
普通光学显微镜。
【试剂】
所用墨汁为适量的生理盐水与一得阁墨汁混匀，在低倍镜下观察以淡黄色可见墨汁细微颗粒为宜。
【操作步骤】
1.染色镜检
（1）将标本用Cytospin离心机离心制成涂片，固定。
（2）将一滴墨汁滴于涂片上，再在墨汁上覆盖盖玻片，注意先将盖玻片一边接触墨汁而后缓缓斜放下，使其不产生气泡。
（3）在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，找到后，转换高倍镜确认。
2.结果报告
（1）如果涂片在墨汁的黑背景下呈现清楚的晕圈，并且在晕圈内可见菌细胞，报告“墨汁染色阳性”，瓶描述孢子数量及出芽情况。
（2）如果涂片在墨汁的黑背景下无清楚的晕圈，报告“墨汁染色阴性”。
3.注意事项
（1）加的墨汁不要太多，以免加盖玻片时外溢造成污染。
（2）脑脊液墨汁染色阳性则高度怀疑新型隐球菌。
（3）注意将隐球菌与白细胞进行仔细鉴别，隐球菌菌体中央有折光颗粒，而白细胞没有。
（4）因为墨汁染液不能高压灭菌，每次操作应进行阴性对照。以防墨汁污染造成假阳性报告。
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