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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验101-110

作者:王泓 日期:2014-06-19

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101.丙型肝炎病毒抗体（Anti-HCV）

【临床意义】
HCV抗体阳性提示个体可能感染过HCV病毒、或可能为HCV病毒携带者并具有传染性。尽管大部分被感染者没有症状，但是HCV病毒持续感染可以发展为慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌。通过对献血液者进行筛选可以使输血传播HCV的风险显著下降。
【标本要求】 1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
2.采样量静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
3.保存分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
【方法与原理】
1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemiluminescent Microparticle Immuno Assay，CMIA）。定性检测人血清和血浆中的丙型肝炎病毒抗体（Anti-HCV）。
2.原理 ARCHITECT HCV抗体检测是一种两步免疫检测法。首先，样本与HCV重组抗原包被顺磁微粒子和测试稀释液混合。样本中的HCV抗体结合至丙肝病毒包被微粒子上。冲洗后，加入抗-人IgG吖啶酯标记的结合物。再次冲洗之后，向反应混合物中加入预激发液和激发液。通过相对发光单位（RLUs）对产生的化学发光反应进行测量。样本中的丙肝病毒抗体数量与ARCHITECT i*光学系统检测到的RLU成正比。把反应产生的化学发光信号和系统校准生成的临界信号值进行比较。化学发光信号如大于或等于临界信号值，该样本可测定为HCV抗体阳性。
【仪器】
美国雅培公司ARCHITECT 12000全自动免疫发光分析仪。
【试剂】
1.美国雅培公司ARCHITECT Anti-HCV测定试剂盒
（1）微粒子：在MES缓冲液中配制的HCV（大肠杆菌，酵母，重组体）包被微粒子。
（2）结合物：在MES缓冲液中制备的吖啶酯标记鼠抗-IgG／抗-IgM结合物。
（3）检测稀释液：TRIS缓冲液制备的测试稀释液。
2.其他试剂
（1）预激发液：含1.32% （W／V）过氧化氢。
（2）激发液：含0.35mol／L氢氧化钠。
（3）洗涤液：在TRIS缓冲液中制备的HCV抗体测试稀释液。
3.ARCHITECT Anti-HCV配套质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。
4.ARCHITECT Anti-HCV配套校准品：校准品1。
试剂盒在ARCHITECT i系统上最长可以储存30天。30天后，必须丢弃试剂盒。
【操作步骤】
1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibration order，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
执行ARCHITECT Anti-HCV校准时，需要对校准品1重复检测三次。Anti-HCV所有质控水平必须取一个样本进行检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。一旦ARCHITECT Anti-HCV校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
（1）使用新批号的试剂盒。
（2）质控值在范围之外。
2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目Anti-HCV，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
建议每24小时检测一次质控品。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
（1）更换试剂批号。
（2）重新定标后。
（3）质控值在规定范围之外。
（4）仪器移动或故障维修后。
3.样本测定在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目Anti-HCV，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
4.试剂装载检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
【性能参数】
1.精密度 %CV≤13.1。
2.灵敏度 97.10%。
3.特异性 99. 60%。
【参考范围】
结果解释：
1.S/CO＜1.0为阴性。
2.S/CO≥1.0为阳性。
3.其中S/CO介于1.0～4.0（ARCHITECT i2000）之间的检测值应视为灰区范围，需进一步复检。如复检结果仍为阳性，样本应使用其他特异性免疫检测法或免疫印迹法（RIBA）进行检验。
【参考文献】
1.刘丽君，魏来.丙型肝炎病毒的流行病学.传染病信息，2007，20:261-264
2.杨瑞锋，魏来.丙型肝炎病毒感染的检测.临床肝胆病杂志，2011，27：（1）
3. Alter MJ，Kuhnert WL，Finelli L，et aL Guidelines for laboratory testing and result repor- ting of antibody to hepatitis C virus. MMWR Recomm Rep，2003，52（RR-3）:1-16
4.NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Dis-eases Transmitted by Blood，Body Fluids and Tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu- ment M29-A（ISBN 1-56238-339-6）. NCCLS，Wayne，PA 19087； 1997
5. Lee Dong-Soon. Significance of anti-E2 in the diagnosis of HCV infection in patients on maintenance hemodialysis. Journal of the American Society of Nephrology，1996，7 （11）: 2409-2413
【临床意义】
HEV属杯状病毒，粪-口途径传播，与甲肝相似，为急性发病并具有自限性，较少发展为慢性。急性期血清抗戊型肝炎病毒抗体IgM（抗HEV IgM）阳性可诊断为HEV感染。
【标本要求】
1.种类 血清或血浆（肝素、枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
2.标本量 静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
3.保存 血清或血浆标本分离后7天之内可放置于2～8℃保存，超过7天在-20℃保存。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫法。
2.原理 兔抗人IgMμ链包被酶免疫微孔板，加入待测定血清后，可捕获血清／浆中的HEV IgM抗体，当加入辣根过氧化物酶标记的基因重组抗原（HEVAg HRP）后，血清HEV IgM抗体与HEVAg HRP结合。辣根过氧化物酶催化加入的底物（TMB）溶液显色，其颜色深浅与血清或血浆中的HEV特异性IgM含量成正比。
【仪器】
酶标仪，洗板机和振荡器。
【试剂】
上海实业科华生物技术有限公司产品。
1.兔抗人IgMμ链包被微孔板。
2.酶结合物辣根过氧化物酶标记的基因重组抗原（HEVAg HRP）。
3.HEV IgM阳性和阴性对照。
4.样品稀释液。
5.浓缩洗涤液。
6.底物液（TMB）。
7.终止液（2mol／L H2SO4）。
【操作步骤】
1.按照所需数量在板架上放好酶标板条，按顺序编号。
2.每孔加入100μl样品稀释液，再加入待检标本10μl充分混匀。设立阴性、阳性及空白对照，各加100μl阴性及阳性对照（不用稀释），设空白对照。
3.置37℃温育30分钟。
4.用洗涤液洗板5次。
5.每孔加酶结合物100μl，空白对照不加。
6.振荡均匀，置37℃温育30分钟。
7.用洗涤液洗板5次。
8.每孔加底物液A液及B液各50μl，振荡均匀，置37℃温育10分钟。
9.每孔中加终止液50μl。
10.在450nm波长测定OD值，用空白对照校零。
11.结果判定
（1） Cut-off值计算：Cut-off=0.25+阴性对照平均OD值
（2）结果判定：标本OD值≥Cut-off值为阳性。标本OD值＜Cut-off值为阴性（阳性对照OD值低于1.3或阴性对照OD值高于0.15，检测结果无效）。
【性能参数】
1.敏感性 100%。
2.特异性 100%。
3.精密度 ≤15%。
【参考范围】
阴性。
【参考文献】
1.李金明，胡志东，钟述猷.戊型肝炎研究新进展.国外医学：流行病学·传染病学分册2004，（04）
2.王佑春.中国戊型肝炎病毒4型的流行病学、分子生物学和家畜感染研究.中华流行病学杂志，2003，（07）
3.病毒性肝炎防治方案.传染病信息，2000，（04）
4.庄辉.重视戊型肝炎研究.中华肝脏病杂志，2004，（01）
5.赵晨燕，李卓，郝娃，等.戊型肝炎病毒抗体检测试剂的比较.中国生物制品学杂志，2010， （03）
【临床意义】
RPR为梅毒血清学非特异性实验。某些自身免疫性疾病患者（如SLE、硬皮病）及孕妇等会出现生物学假阳性反应，但多为弱反应。RPR阳性标本应做梅毒螺旋体特异性试验加以确诊。虽然RPR结果为非特异性，但敏感性较高，操作方便，因此作为梅毒的快速筛选试验。另外，抗脂质抗体（反应素）与临床症状有较好的关联，半定量结果可用于疗效判断和观察预后。
【标本要求】
普通管静脉血2～3ml，常规分离血清后，2～8℃保存7天。
【方法与原理】
1.方法非特异性间接凝集反应。
2.原理梅毒螺旋体感染机体后，在破坏组织的过程中，释放出一种抗原性磷脂，它能刺激人体产生反应素，检测时用人工合成的类脂质抗原（致敏在活性炭颗粒上）与被检血清反应，发生凝集，提示血清中有该反应素，用于梅毒早期实验室筛查。
【仪器】
混旋器。
【试剂】
上海实业科华生物技术有限公司产品。
1.RPR抗原 用类脂质抗原（心磷脂、卵磷脂、胆固醇等）致敏的活性炭颗粒。
2.质控品 阳性、阴性对照。
3.配套品 RPR反应卡片及塑料加液滴管（每滴约17μl）。
【操作步骤】
1.取待检血清50μl加于卡片上（包括阳性、阴性对照），并涂满整个卡圈。
2.在每份血清上加1滴RPR抗原。
3.放在混旋器上旋转8分钟肉眼观察结果。阳性结果判断：标本反应液中出现黑色凝集颗粒或絮片。阴性结果判断：不出现黑色凝集颗粒。RPR反应阳性标本，依反应强弱做1: 2～1：32倍稀释，操作方法同上，以确定滴度（半定量）。
【参考范围】
阴性。
【参考文献】
1.杨芳，邢文革.梅毒检测策略的应用现状，中国艾滋病性病，2009，15（5）：549-555
2.陈祥生.我国梅毒流行现状及防治策略.国际流行病学传染病学杂志，2008，35（2）：73-77
3.彭锐锐，李婧，陈祥生.梅毒螺旋体分子流行病学研究进展，中国艾滋病性病，2010，16（2）： 192-194
【临床意义】
梅毒螺旋体抗体（含IgG、IgM）检测主要用于对梅毒患者的辅助诊断。梅毒是由TP螺旋体感染引起，可通过先天遗传或性交传播。潜伏期内的梅毒感染在临床上表现不显著。梅毒螺旋体抗体检测，具有较高的敏感性和特异性，适合于对大量标本的筛查，但因其也存在非特异性反应，故阳性标本还应进一步做确证试验（TPPA、TPHA、FTA-ABS等）。由于该检测含IgG型抗体，所以即使在抗原消失后，抗体仍可长时间存在，甚至终身携带，因此其结果不能作为疗效观察和判断复发的指标。
【标本要求】
1.种类 血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
2.量 静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
3.保存 分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
【方法与原理】
1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemiluminescent Microparticle Immuno Assay，CMIA）。采用两步法，定性检测人血清或血浆中的TP抗体。
2.原理首先将样本、重组TP抗原（TpN15、TpN17和TpN47）包被的微粒子和稀释液混合。样本中的抗TP抗体将与TP包被的微粒子相结合。冲洗后加入抗人吖啶酯标记的IgG和IgM结合物。再次冲洗后，向反应混合液中加入预激发液和激发液。测量化学发光反应的结果，以相对发光单位（RI.Us）表示。样本中的抗TP抗体含量和ARCHITEC i*光学系统检测到的RLUs值成正比。将测得的化学发光信号与系统校准确定的cutoff值进行比较，从而确定样本中是否存在抗TP抗体。如果样本的化学发光信号大于或等于cutoff值，那么说明该样本对TP抗体呈反应性。
【仪器】
美国雅培公司ARCHITECT 12000全自动免疫发光分析仪。
【试剂】
1.美国雅培公司ARCHITECT Syphilis TP测定试剂盒
（1）微粒子：包被了TP（大肠杆菌，重组体）抗原的微粒子。
（2）结合物：标记了吖啶酯的鼠IgG抗体／IgM抗体的结合物。
（3）稀释液，含MES的缓冲液。
2.其他试剂
（1）预激发液：含1.32%（W/V）过氧化氢。
（2）激发液：含0.35moI/L的氢氧化钠。
（3）清洗缓冲液：含磷酸盐的浓缩缓冲液。
3.ARCHITECT Syphilis TP配套质控品：阳性质控品和阴性质控品。
4.ARCHITECT Syphilis TP配套校准品：校准品1。
试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
【操作步骤】
1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibration order，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
执行Syphilis TP校准时，需要对校准品1重复检测三次。Syphilis TP的所有质控水平样本必须进行检测，用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。一旦校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
（1）使用新批号的试剂盒。
（2）质控值在范围之外。
2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中Control order，选择要分析的项目Syphilis，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
建议每24小时检测一次质控品。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
（1）更换试剂批号。
（2）重新定标后。
（3）质控值在规定范围之外。
（4）仪器移动或故障维修后。
3.样本测定 在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目Syphilis，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
4.试剂装载 检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
【性能参数】
1.精密度 %CV≤15%。
2.灵敏度 ≥99.0%。
3.特异性 ≥99.0%。
【参考范围】
1.S/CO值＜1.0时为无反应性。
2.S/CO值≥1.0的样本为有反应性。
【参考文献】
1.侯晓菁，梁艳，陈洁，等.化学发光法检测梅毒螺旋体特异性抗体的实验评价.检验医学 2010，（5）：
2.熊继红，卢建强.化学发光法与ELISA法检测梅毒抗体的一致性比较，检验医学与临床， 2011， （3）
3.刘惠.北京市1994～1998年梅毒流行病学分析.中华流行病学杂志，2000，（2）
4. Carvalho L，Largua A. The use of an automated chemiluminescent assay for screening of syphilis diagnostic. Clin Chem Lab Med，2008，46:339-340
5. Meyer JC. Laboratory Diagnosis of Syphilis. Curr Probl Dermat01，1996，24:1-11
6. NCCLS.Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods； Approved Guideline-Second Edition.NCCLS Document EP5-A2 （ISBN l-56238-542-9）. NCCLS，940 West Valley Road，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898 USA，2004
【临床意义】
多年来国内常用的梅毒确认试验为梅毒螺旋体血凝试验（TPHA），该试剂是用梅毒螺旋体为抗原致敏醛化的禽类红细胞制成，由于红细胞具有生物活性，可能产生非特异性凝集，且保存时间较短，故近年来推出换代产品TPPA试验。TPPA以纯化的梅毒螺旋体抗原致敏情性的人工明胶颗粒替代TPHA试验中的致敏红细胞，使结果更为稳定，敏感性和特异性也得到进一步提高。TPPA检测的是梅毒螺旋体特异性抗体，包括IgM型和IgG型，可作为梅毒的确证试验，但不适合用作治疗效果的监测。
【标本要求】
普通管静脉血2～3ml，常规分离血清后，2～8℃保存7天。
【方法与原理】
1.方法 梅毒螺旋体明胶颗粒凝集法。
2.原理 将梅毒螺旋体（Treponema pallidum）的精制菌体成分包被在人工载体明胶粒子上，这种致敏粒子和标本中的梅毒螺旋体抗体进行反应发生凝集，产生粒子凝集反应（particle agglutination test），由此可以检测出血清和血浆中的梅毒螺旋体抗体。本实验可作为梅毒确证试验。
【仪器】
微量振荡器。
【试剂】
1.日本富士公司产品。
（1）A：复溶液，8. 0ml×1瓶。
（2）B：标本稀释液，29.0ml×1瓶。
（3）C：致敏粒子，0. 6ml×5瓶。
（4）D：未致敏粒子，0. 6ml×5瓶。
2.配套品 25μl滴管2支。
3.阳性质控品：效价1: 320，0.5ml×1瓶。
【操作步骤】
1.在微量反应板的第1孔加入标本稀释液100μl，从第2孔至第4孔每孔加25μl。
2.用微量加样器取标本25μl至第1孔中，然后以2n的方式从第1孔稀释至第4孔。
3.用滴管在第3孔中滴入1滴（25μl）未致敏粒子，在第4孔中滴入1滴（25μl）致敏粒子。
4.用微量振荡器混合30秒，加盖后于室温（15～30℃）下避光水平静置。2小时后观察结果。
5.结果判断
（1）阴性：粒子成纽扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。
（2）弱阳性：粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。
（3）阳性：粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱地凝集在周围；或产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展。
【参考文献】
1.杨芳，邢文革.梅毒检测策略的应用现状.中国艾滋病性病，2009，15（5）:549-555
2.陈祥生.我国梅毒流行现状及防治策略.国际流行病学传染病学杂志，2008，35（2）:73-77
3.彭锐锐，李婧，陈祥生.梅毒螺旋体分子流行病学研究进展.中国艾滋病性病，2010，16（2）： 192-194
4.Centers for Disease Control and Prevention. Sexually Transmitted Disease Surveillance 2005 Supplement，Syphilis Surveillance Report［R］Atlanta，GA:US Department of Health and Human Services，Centers for Disease Control and Prevention，December 2006 1-24
【临床意义】
艾滋病，是人获得性免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）所致的一种严重传染病。通过检测血清或血浆中的HIV抗原或抗体可以证实HIV感染。HIV抗原仅在急性期感染和AIDS期才可以检测到。HIV抗体则可以在HIV感染以后很短的一段时间直到艾滋病阶段都可以检出。因此，高敏感性的HIV抗体+p24抗原联合检测，可以缩短窗口期，有利于早期诊断HIV感染，有效防止HIV病毒通过血液或血液制品传播。
【标本要求】
1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
2.保存血清或血浆分离后7天之内测定的标本可放置于2～8℃保存，超过7天在-20℃保存。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫一步夹心法。
2.原理 基于ELISA 一步法原理。以HIV抗原和HIV抗体的混合物标记辣根过氧化物酶（HRP）作为酶结合物，以四甲基联苯胺（TMB）和过氧化物作为底物。完成实验后，如果有颜色产生，提示存在HIV抗原或HIV抗体，如果没有颜色或只有非常浅的颜色，提示不存在HIV抗原或HIV抗体。
在酶标板孔内包备有特异性的成分：HIV-1 gp160、HIV-1 ANT70肽、HIV-2 env肽（氨基酸592-603）和抗-HIV-1 p24。在每个酶标板孔内同时包含有辣根过氧化物酶标记的相同的HIV抗原／抗体混合物的复合物。如果在样品中含有HIV-1或HIV-2抗体，将会形成固相抗原-抗体-酶标记抗原复合物。如果在样品中含有HIV-1抗原，将会形成固相抗体-抗原-酶标记抗体复合物。随加入TMB底物，如果在样品中存在HIV-1抗体，HIV-2抗体，HIV-10亚型抗体或HIV抗原，将会产生显色反应。相反，则在加入底物后不会显色。
【仪器】
酶标仪、洗板机和振荡器。
【试剂】
生产商：上海梅里埃生物工程有限公司。
试剂盒成分：
1.微量酶标板 每板12条，每条8孔。包被有HIV-lgp160、HIV-1ANT70、HIV-2 env（氨基酸592-603）和抗-HIV-1p24。
2.酶复合物 每个酶标板孔中有冻干珍珠状的酶复合物，为HRP标记HIV-1gp160、HIV-1 ANT70、HIV-2 env（氨基酸592-603）和抗HIV-1p24（鼠单抗）。
3.阴性对照 不含HIV抗原／抗体的人血清。
4.抗-HIV-1阳性对照 含有单克隆抗-HIV-1的人血清。
5.抗-HIV-2阳性对照 含有鼠单克隆抗-HIV-2的人血清。
6.HIV-1抗原阳性对照 HIV-1 p24（灭活）。
7.样品稀释液 含有蛋白稳定剂和去垢剂。
8.浓缩磷酸盐缓冲液 使用蒸馏水或去离子水进行25倍稀释。
9.TMB溶液 溶于枸橼酸的四甲基联苯胺。
10.尿过氧化物溶液。
【操作步骤】
1.按照所需数量在板架上放好酶标板条，撕去酶标板条上的封条。
2.所有孔加入100μl的样品稀释液，包括对照孔。
3.相应孔中加入50μl样品或质控对照。每一酶标板上要有3个阴性质控对照和1个抗- HIV-1阳性对照，如果有需要，加入抗-HIV-2阳性对照（50μl）和1个HIV-1抗原阳性对照（50μl）。
4.在未使用的酶标板孔内加入样品稀释液，用于溶解酶复合物球，以避免损坏洗板机。
5.振荡，［使用微板振荡器，15Hz，（900转／分钟，振荡15秒钟）］。
6.在（37±2）℃孵育（60±5）分钟。
7.用洗板机洗板6次（不完全的洗板会影响结果）。
8.每孔加入100μl TMB底物，不要振荡。
9.在（15～30）℃孵育（30±2）分钟。
10.加入100μl硫酸终止实验反应（按照加入底物的顺序和时间间隔）。保证充分混匀在15分钟内进行读数。
11.以空气读空白（不放板架和板条），在450nm（单波长）或450nm和620～700nm参考波长进行读数。
12.结果判定
（1）手工计算：每一块酶标板要单独进行计算。NC-阴性质控的吸光度值，PCl=抗HIV-1阳性质控吸光度值，PC2-抗HIV-2阳性质控吸光度值。
（2） NC值的要求：NC必须小于0.25；去掉大于等于0.25的阴性质控对照；计算小于0. 25的阴性质控平均值（NCx）；NC必须在0.6NCx和1.4NCx之间；去掉NC小于0.6NCx和大于1.4NCx的阴性质控对照。
（3）实验结果有效性须满足下列条件：
a）多于半数的阴性质控对照符合要求。
b） PCl-NCx≥0. 600。
c） PC2-NCx≥0.600（如果使用）。
d） PC3-NCx≥0.400（如果使用）。
（4）计算界限值：Cut off=NCx+0. 100
（5）样品OD值≥Cut off，判定为阳性反应。
（6）样品OD值＜Cut off，判定为阴性反应。
【性能参数】
1.敏感性 100%。
2.特异性 99. 9%。
【参考范围】
阴性。
【参考文献】
1.中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范.2009，9
2.张麒，佐拉，秦光明，等.评估第4代HIV酶联免疫法诊断试剂对静脉吸毒者感染窗口期的检测能力.中华检验医学杂志，2006，（07）
3.刘鱼，王憬惺，黄毅.HIV-1 P24抗原检测系统及应用研究进展.中国输血杂志，2009，（01）
4. Polywka S Puttmann H，I.ubben F，et al.A new combined HIV p24 antigen and ant，N- HIV-1／2/0 Screening assay. Methods Mol Biol，2005，304:229-243
5.许文燕，邱茏锋，佐台拉·吐尔地，等.第四代HIV抗原抗体酶联检测试剂缩短HIV检测 窗口期的研究.中华检验医学杂志，2007，30（3）：284-286
6.许四宏，李秀华，宋爱京，等.第四代HIV抗原抗体联合检测剂的评价.中国输血杂志， 2006，19（3）：188
【临床意义】
本试验定性检测血清和血浆中HIV-1和HIV-2抗体，适用于无偿献血员的现场初筛和临床紧急情况使用。初筛阳性时，需进一步做ELISA法检测。
【标本要求】
1.种类 血清或血浆（肝素、枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
2.标本量 静脉血2ml常规分离血清或血浆。
3.保存 分离后7天之内测定的血清或血浆标本可放置于2～8℃保存，超过7天在-20℃保存。
【方法与原理】
1.方法 胶体硒法。
2.原理 利用免疫层析原理，标本靠毛细作用移动通过结合物包被处，与硒胶体一抗原结合物混重组结合，继续迁移至检测区，如标本含HIV1／2抗体，被固相包被的合成肽和重组抗原所捕捉固定，形成一条红线；如标本中无HIV1／2抗体，则硒胶体-抗原结合物将会通过检测区，而没有红线。余下混合物继续移动至质控区形成红线。
【试剂】
雅培公司产品。
HIV1/2抗体胶体硒检测拭子条。
【操作步骤】
1.拆开每个测试条的外包装并编号，加50μl血清或血浆标本于标本反应垫中（箭头所指处），室温等待15～60分钟观察结果。结果判断：阳性结果为两条红线（患者窗口、质控窗口各一条）；阴性结果仅质控窗口一条红线；无效时无红线。
2.结果判断
（1）阴性：检测窗口无红线。
（2）阳性：检测窗口有红线。
（3）无论检测结果为阴性或阳性，标本都需使用ELISA法做进一步检测。
【参考文献】
1.中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范.2009，9
2.余育胜，王槐堂，郑曦.抗凝剂EDTA-K2对胶体硒免疫层析试验的影响.中国艾滋病性病， 2008，1
3.尚红.HIV检测及临床意义.齐鲁医学检验，2004，05
【临床意义】
解脲脲原体是正常人生殖道可以分离出的一种支原体。是不孕症、生殖道炎症等疾病近几年来常规检查项目之一。临床资料证明，解脲脲原体与不孕症、自然流产、死胎、女性生殖道炎症等威胁女性健康的疾病有一定的关系。资料显示，在女性常见的生殖道炎症中，解脲脲原体占非淋球菌阴道炎的67.6%；在宫颈炎和阴道炎病例中，解脲脲原体检出率为67%；在不育夫妇中，大约有90%的妇女感染了解脲脲原体，而正常女性仅22%可以检测出解脲脲原体。所以当不孕症患者查不出原因的时候，应检查解脲脲原体。解脲脲原体感染导致生殖道炎症，使黏膜细胞坏死，输卵管中的纤毛失去运动功能，受精卵运动受到抑制；解脲脲原体可直接吸附在精子的头部，破坏精子的活力，影响精子与卵子的正常结合，患者难以正常受精。解脲脲原体还与精子膜有共同抗原，一旦感染就有可能导致免疫性不孕。在不孕症中，解脲脲原体感染率在55. 2%～80%之间。孕妇一旦感染解脲脲原体，很容易发生低体重儿、新生儿呼吸道感染、胎儿死亡等严重后果。
【标本要求】
1.标本采集
（1）尿样标本：取清晨首次尿，或长时间（至少1小时）不排尿后的首段尿0. 5ml，与0.5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
（2）拭子标本：用医用棉拭子伸入男性尿道口或女性宫颈口约1～2cm，旋转1周，停留10秒钟后取出后，将拭子头放入1ml生理盐水浸泡贴管壁挤干，取0. 5ml加入0.5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
2.保存 待测样本在2～8℃保存不应超过30天，-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存，应避免反复冻融。
3.运输 密封冷藏（2～8℃）运输。
【方法与原理】
本试剂盒的解脲脲原体核酸检测分为核酸提取和恒温扩增检测。
在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统离心操作的情况下，通过清洗磁性颗粒而获得纯净的细菌靶标核酸（RNA）。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Tes-ting，SAT）使用M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从双链DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照、阴性对照和界值参考品对检验结果进行判定。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）、磁力架、电动吸引器。
【试剂】
上海仁度生物科技有限公司解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
试剂组成：

组成成分
包装盖颜色
规格
尿样保存液
核酸提取液
洗涤液
UU反应液
UU检测液
SAT酶液
UU阳性对照
UU阴性对照
白
白
白
黄
棕
紫
红
绿
1×10ml
2×1ml
1×40ml
1×800μl
1×50μl
1×200μl
1×50μl
1×50μl

（1）尿样保存液：含去垢剂，用于保存细菌RNA。
（2）核酸提取液：含捕获探针和磁性颗粒，用于结合病原体RNA。
（3）洗涤液：含SDS。
（4） UU反应液：含dNTPs、NTPs和扩增所需组分。
（5） UU检测液：含UU特异引物、特异荧光探针。
（6） SAT酶液：含逆转录酶，T7聚合酶。
（7） UU阳性对照：含UU RNA。
（8） UU阴性对照：不含任何核酸，用于检验操作过程及试剂的有效性。
【操作步骤】
1.试剂准备按照每人份40μl反应液+2.5μl检测液配制扩增检测液，混匀备用。
2.核酸提取
（1）取400μl已加好尿样保存液的标本（阴阳对照的做法是200μl生理盐水+200μl尿样保存液+10μl对照），加入100μl核酸提取液。震荡，60℃温浴5分钟，再室温放置10分钟。
（2）将其放在磁力架上，吸附磁珠5分钟。待磁珠吸附到管壁一侧后，用真空泵吸走废液。然后加入1ml洗涤液，震荡混匀，继续吸附。吸附好后，再次吸走废液。再重复洗涤一次。
（3）最后一次要尽量吸干净废液，然后向其中加入步骤1中配好的扩增检测液40μl，震荡，让磁珠悬浮其中。然后转移30μl到微量反应管中。60℃温浴10分钟，然后再42℃温浴5分钟。然后每孔加入42℃预热好的SAT酶10μl。
3.上机扩增提前打开核酸扩增仪并设置扩增程序（42℃，40分钟，每分钟采一次荧光，选取FAM通道）。加好酶后要马上放入核酸扩增仪进行扩增。
4.质量控制 （1）应用临界弱阳性对照进行实验室质控：为了防止出现漏检（假阴性）的情况，SAT检测实验室应定期应用临界弱阳性对照进行室内质量控制。
a）临界弱阳性对照的制备：取生理盐水和尿样保存液按照1:1混合作为稀释液，将试剂盒提供的阳性对照（2000CFU/反应）稀释40倍即为临界弱阳性对照（50CFU/反应）。
b）临界弱阳性对照的使用方法：取0.2ml生理盐水加入0.2ml尿样保存液中，混匀后加入10μl临界弱阳性对照，混匀备用；样本处理和检测过程同阳性对照和阴性对照。
（2）实验质量控制：所设置阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的检测时间（detection time，dt）值应满足以下条件：界值参考品的dt在10≤dt≤20；阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40；否则，实验视为无效需重新进行。
注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似）。
5.结果判定
（1）阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
（2）结果判断
a） dt≤35的样本为阳性（UU菌携带者）。
b）dt≤界值参考品的dt值，表明样本中UU菌总数≥104 CFU／ml，需要进行临床干预治疗。
c） 35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性；dt无数值或为40的样本为阴性。
注：①dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似）。
②界值参考品的dt在10≤dt≤20，这是一个参考范围，每个实验室应根据具体的仪器环境，建立自己的dt范围。
【参考范围】
通过对界值参考品浓度UU培养物进行大量实验统计分析，确定其99%置信区间的dt值范围为：10≤dt≤20；通过对检测下限浓度UU培养物大量实验统计分析，并结合健康体检者样品和阳性样品的实验数据，确定95%置信区间为：dt≤35，99%置信区间的dt值范围为：dt＜40。
【临床意义】
淋病（gonorrhea）是淋菌性尿道炎的简称，是由淋球菌引起的泌尿生殖系统化脓性炎性疾病，主要通过性传播。该病致病病原体是淋病奈瑟菌，又称淋病双球菌、淋球菌、淋菌，是奈瑟于1879年首先发现的。30年来，无症状带菌者的增多（女性患者高达75%）、避孕方法的改变（避孕药取代了子宫帽、避孕套）以及耐药菌株的不断出现，更加快了本病的传播。在许多国家和地区，淋病的患病率一直居于各种性传播疾病的首位。本病最初多侵犯尿道、宫颈内膜，继而可波及前列腺、精囊、附睾、子宫内膜及输卵管。有时肛门、直肠、咽黏膜、眼结膜也可受染。尚可经血行播散引起菌血症、关节炎、心内膜炎及脑膜炎，可引起死亡或不育、不孕、失明及尿道狭窄等后果。由于本病潜伏期短、传染性强、后果严重，因此它是我国当前重点防治的性病之一。淋病的好发年龄为性活跃的中青年，但可发生于任何年龄。一般分为单纯性淋病、有并发症淋病和播散性淋病。
【标本要求】
1.标本采集
（1）尿样标本：取清晨首次尿，或长时间（至少1小时）不排尿后的首段尿0. 5ml，与0.5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
（2）拭子标本：将医用棉拭子伸入男性尿道口或女性宫颈口约1～2cm，旋转1周，停留10秒钟后取出放入1ml生理盐水浸泡贴管壁挤干，取0.5ml加入0. 5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
2.保存待测样本在2～8℃保存不应超过30天，-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存，应避免反复冻融。
3.运输密封冷藏（2～8℃）运输。
【方法与原理】
本试剂盒的淋球菌核酸检测分为核酸提取和恒温扩增检测。
在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统离心操作的情况下，通过清洗磁性颗粒而获得纯净的细菌靶标核酸（RNA）。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Tes-ting，SAT）使用M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从双链DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照和阴性对照对检验结果进行判定。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）、磁力架、电动吸引器。
【试剂】
上海仁度生物科技有限公司淋病奈瑟菌（NG）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
试剂组成：

组成成分
包装盖颜色
规格
尿样保存液
核酸提取液
洗涤液
NG反应液
NG检测液
SAT酶液
NG阳性对照
NG阴性对照
白
白
白
黄
棕
紫
红
绿
1×10ml
2×1ml
1×40ml
1×800μl
1×50μl
1×200μl
1×50μl
1×50μl

（1）尿样保存液：含去垢剂，用于保存细菌RNA。
（2）核酸提取液：含捕获探针和磁性颗粒，用于结合病原体RNA。
（3）洗涤液：含SDS。
（4）NG反应液：含dNTPs、NTPs和扩增所需组分。
（5）NG检测液：含NG特异引物、特异荧光探针。
（6）SAT酶液：含逆转录酶，T7聚合酶。
（7） NG阳性对照：含UNGRNA。
（8） NG阴性对照：不含任何核酸，用于检验操作过程及试剂的有效性。
【操作步骤】
1.试剂准备 按照每人份40μl反应液+2.5μl检测液配制扩增检测液，混匀备用。
2.核酸提取
（1）取400μl已加好尿样保存液的标本（阴阳对照的做法是200μl生理盐水+200μl尿样保存液+10μl对照），加入100μl核酸提取液。震荡，60℃温浴5分钟，再室温放置10分钟。
（2）将其放在磁力架上，吸附磁珠5分钟。待磁珠吸附到管壁一侧后，用真空泵吸走废液。然后加入1ml洗涤液，震荡混匀，继续吸附。吸附好后，再次吸走废液。再重复洗涤一次。
（3）最后一次要尽量吸干净废液，然后向其中加入步骤1中配好的扩增检测液40μl，震荡，让磁珠悬浮其中。然后转移30μl到微量反应管中。60℃温浴10分钟，然后再42℃温浴5分钟。然后每孔加入42℃预热好的SAT酶10μl。
3.上机扩增 提前打开核酸扩增仪并设置扩增程序（42℃，40分钟，每分钟采一次荧光，选取FAM通道）。加好酶后要马上放入核酸扩增仪进行扩增。
4.质量控制
（1）应用临界弱阳性对照进行实验室质控：为了防止出现漏检（假阴性）的情况，SAT检测实验室应定期应用临界弱阳性对照进行室内质量控制。
a）临界弱阳对照的制备：取生理盐水和尿样保存液按照1：1混合作为稀释液，将试剂盒提供阳性对照品（105 copies/反应）稀释100μl倍即为临界弱阳性对照（103 copies/反应）。
b）临界弱阳性对照的使用方法：取0. 2ml生理盐水加入0.2ml尿样保存液中，混匀后加入10μl临界弱阳性对照，混匀备用；样本处理和检测过程同阳性对照和阴性对照。
（2）实验质量控制：所设置阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的检测时间（detection time，dt）值应满足以下条件：阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40；否则，实验视为无效，需重新进行。
注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的Ct值类似）。
5.结果判定
（1）阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
（2）结果判断
a） dt≤35的样本为阳性。
b） 35＜dt＜40的样本建议重新检测，再次检测结果dt＜40的样本为阳性。
c） dt无数值或为40的样本为阴性。
【参考范围】
通过对检测下限浓度RNA大量实验统计分析，并结合体检者样品和阳性样品的实验数据，确定95%覆盖下dt≤35；99%覆盖下dt＜40。
【临床意义】
HCMV通常由口腔、生殖道、胎盘、输血或器官移植等多途径传播。人对HCMV普遍易感。HCMV主要引起机会性感染。胎儿期和新生儿容易发生HCMV的显性感染。化疗和放疗的肿瘤患者、器官移植、自身免疫病患者以及艾滋病患者极易通过感染而发病。HCMV还在人类动脉粥样硬化中起关键作用。由于免疫功能低下也可使机体潜伏状态的病毒激活而发病。
人巨细胞病毒DNA检测，敏感性强，利于早期诊断。检测HCMV DNA有助于诊断是否HCMV感染引起疾病加重；通过监测病毒活跃程度，可以观察抗病毒治疗的效果。
HCMV DNA水平检测更适于应用在AIDS的活动性HCMV感染的监测以及血液白细胞过少难于进行PP65检测的标本，并且可对尿液、乳汁等标本检测。
【标本要求】
1.种类尿液、乳汁、血清或淋巴细胞。
2.标本取样量及保存方法
（1）尿液、乳汁：取晨尿或成熟乳3～5ml于无菌的干燥玻璃管中，密闭送检。
（2）血清、血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的血清或EDTA抗凝的血浆采血管中，使用水平离心机，2000转／分钟离心10分钟；吸取上清至1. 5ml灭菌离心管中。
（3）全血（淋巴细胞）：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的采血管中，立即轻轻颠倒采血管，混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。全血标本可立即用于测试，也可保存于4℃待测，保存期为24小时。
（4）标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测（全血经分离后，保存其血浆或血清），保存期为6个月。标本运送采用O℃冰壶。
【方法与原理】
1.方法实时荧光定量PCR检测法。
2.原理选取人巨细胞病毒株（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针，扩增片段长度为86bp，利用实时荧光定量PCR技术，定量检测尿液、乳汁、血清、血浆或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司人巨细胞病毒（HCMV）核酸扩增荧光定量检测试剂盒

组分名称
规格
数量
DNA浓缩液
DNA提取液
HCMVPCR反应液
Taq酶
阴性质控品
HCMV弱阳性质控品
HCMV强阳性质控品
HCMV阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/ml）红色
HCMV阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝/ml）黄色
HCMV阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝/ml）蓝色
HCMV阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）绿色
2000μl／管
500μl／管
400μl管
60μl／管
50μl／管
200μl／管
200μl／管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.DNA提取
（1）阴性质控品处理：取出阴性质控品，8000转／分钟离心数秒，吸50μl～0. 5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（2）标本处理
1）乳汁（尿液处理同乳汁）
摇匀乳汁，取1～1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟；
去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12 000转／分钟离心5分钟；
去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；
12 000转／分钟离心10分钟，备用。
2）血清、血浆
取100μl血清或血浆加入等量DNA浓缩液充分混匀，12 000转／分钟离心10分钟；
去上清，沉淀中加入20μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；
12 000转／分钟离心10分钟，备用。
3）全血
取全血1ml至干燥无菌试管中，加入生理盐水1ml轻摇混匀；
取干燥无菌试管加入500～700μl淋巴细胞分离液；
将稀释好的全血用加样枪缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中（注意沿着管壁，速度要慢）；1500转／分钟离心20分钟（建议用水平离心机）；
吸取白细胞层（从上而下的第二层），加入1. 5ml离心管，12 000转／分钟离心5分钟；
去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心10分钟，备用。
（3） HCMV弱阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（4） HCMV强阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（5） HCMV阳性定量参考品处理：震荡混匀，8000转／分钟离心数秒，备用。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（HCMV PCR反应液40μl／人份+Taq酶3μl／人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按42.5μl／管分装至LightCy-cler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）上清液2. 5μl，直接加入阳性定量参考品2. 5μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：HCMV反应程序93℃2分钟；93℃12秒→57℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针。选择Abs Quant/Fit Ppoint分析模式，Error＜0.2；efficiency:l. 8～2.1为有效。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品；增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考范围在1.0×105～2.0×106基因拷贝／ml范围，弱阳性质控品定量参考范围在1.0×103～2.0×104基因拷贝/ml范围。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S形曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1或r2≥0. 985。
（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则判样品的HCMV DNA总含量小于检测极限。
（2）如果增长曲线呈S形曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
a）若样品的浓度＜5.0×102基因拷贝／ml，全血、乳汁、尿液样品HCMVDNA总含量＜5.0×102基因拷贝／ml，血清样品HCMV DNA总含量＜2.0×103基因拷贝／ml需重新检测。
b）若样品的浓度5.0×102≤C≤5.0×108基因拷贝/ml，全血、乳汁、尿液样品HCMV DNA总含量=C基因拷贝／rnl，血清样品HCMV DNA总含量=4.0×C基因拷贝/ml。
c）若样品的C＞5. 00E+008，则全血、乳汁、尿液样品HCMV DNA总含量＞5.0×108基因拷贝/ml，血清样品HCMV DNA总含量＞2.0×109基因拷贝／ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
【性能参数】
处理后样品
1.灵敏度为5.0×102基因拷贝/ml。
2.线性范围为5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml。


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