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【医技】检验科医疗诊疗规范——第一篇临床化学与免疫检验71-80

作者:王泓日期:2014-06-19

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71.血清蛋白电泳（SPE）测定

【临床意义】

1.升高

（1）白蛋白升高见于高度失水症（如腹泻、呕吐、休克、高热）。

（2） α1球蛋白升高常见于肿瘤患者、肾病综合征、急慢性感染、心肌梗死、风湿病等。

（3）α2球蛋白升高见于肾病综合征、急慢性感染、风湿病等。

（4）β球蛋白升高见于高脂血症。

（5）γ球蛋白升高见于慢性感染症、肝硬化及肿瘤、多发性骨髓瘤、自身免疫病等。

2.降低

（1）白蛋白降低见于营养不良及吸收障碍、肾病综合征、肝硬化、溃疡性结肠炎、烧伤、失血、恶性肿瘤等等。

（2）α₁球蛋白降低见于肺气肿。

（3）α₁、α₂、β球蛋白降低见于严重肝病。

（4）γ球蛋白降低见于肾病综合征、免疫缺陷等疾病。

【标本要求】

1.空腹取静脉血3.0ml（血清）。

2.分离后的血清标本在室温稳定1天，2~8℃稳定10天，-20℃可保存1个月。

3.避免溶血，溶血标本可出现血红蛋白条带，使α2球蛋白或β球蛋白升高。

【方法与原理】

毛细管电泳法：毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在pH＞3的情况下，其内表面带负电荷和缓冲液接触，形成双电层，在高压电场的作用下，带正电荷的粒子向负极方向移动形成电渗流。同时，蛋白质在电场的作用下，向其所带电荷极性相反方向移动，即电泳，电泳流速度即电泳淌度。带电粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳淌度和电渗流的矢量和。各种蛋白质由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实现分离。

【仪器】

法国Sebia公司全自动毛细管电泳仪系列。

【试剂及配套品】

1.试剂

（1）缓冲液：含碱性缓冲液（pH9.9），添加剂。室温（15~30℃）或冷藏（2~8℃）保存。

（2）清洗液：将70ml储存清洗液用蒸馏水稀释至700ml，工作清洗液室温可保存3个月。

2.稀释杯。

3.过滤器。

4.标本架。

5.CAPICLEAN 含蛋白酶，表面活性剂和添加剂。2~8℃保存至有效期。

6.次氯酸工作液将浓次氯酸溶液（9.6%）250ml用蒸馏水稀释至1L，制成2%~3%的次氯酸工作液。远离光、热、酸和氨，室温可稳定1年。

7.质控血清 Bio-Rad Liquichek CK/LD同工酶质控血清。

【参数设置】

1.温度： 35.5℃

2.进样器真空度：20mBar

3.进样时间： 1秒

4.电泳电压： 7800V

5.电泳时间： 238秒

6.样品稀释倍数：5倍

7.检测波长： 200nm

8.数据采集延迟：81秒

【操作步骤】

1.标本处理：全血标本3000转/分钟离心5分钟，取上层血清分析测定。

2.打开CAPILLARYS2仪器及电脑。

3.启动电泳软件，输入密码“46448630”，显示试剂量，按“OK”。

4.当操作界面上显示仪器状态为“Ready”时，将标本依次插入标本架中，若标本不够一架，在空位上放上装有蒸馏水的小样品杯，稀释杯托上放上稀释杯，样品轨道绿灯亮时，将样品架推入样品轨道，开始测定。每天第一个样品架上，要先做两个水平的质控，质控通过后，再进行其他标本的测定。不同工作日质控血清最好放在样品架的不同位置，保证不同的毛细管都可以有质量控制。

5.将样品架从样品出口处取出。

6.根据电泳结果出报告。

【性能参数】

1.精密度各蛋白组分一次测定重复性（CV%，n=8），白蛋白1.0%~1.4%，α₁球蛋白1.3%~2.6%，az球蛋白1.5%~2.8%，8，球蛋白1.6%~7.6%，β₂球蛋白4.1%~6.3%，γ球蛋白0.9%~1.7%；各蛋白组分多次测定重复性（CV%，n=10），白蛋白0.6%~1.6%，α₁球蛋白1.7%~2.8%，α₂球蛋白0.5%~2.0%，β₁球蛋白2.0%~4.7%，β₃球蛋白2.5%~5.3%，γ球蛋白0.8%~1.9%；各蛋白组分不同批号试剂测定重复性（CV%，n＝3），白蛋白0.4%~1.1%，a，球蛋白2.2%~3.9%，α₂球蛋白1.2%~3.3%，β₁球蛋白1.8%~5.5%，β₂球蛋白1.7%~3.4%，γ球蛋白0.7%~1.6%。

2.准确度各蛋白组分与琼脂糖凝胶方法相关性（相关系数，n＝135），白蛋白0.973，α₁球蛋白0.975，α₂球蛋白0.947，β₁球蛋白0.850，β₂球蛋白0.969，γ球蛋白0.969。

3.灵敏度单克隆蛋白最低检测值27mg/dl，但此值随单克隆蛋白的电泳位置和多克隆蛋白背景的高低而变化。

4.线性范围白蛋白的线性范围到5.2g/dl，γ球蛋白3.1g/dl。

5.干扰溶血（血红蛋白）和血浆（纤维蛋白）影响结果判读。

【参考范围】

白蛋白：52.0%~62.8%，α₁球蛋白：3.1%~4.6%，a2球蛋白：7.0%~11.1%，β₁球蛋白：5.3%~7.8%，β₂球蛋白：3.3%~6.4%，γ球蛋白：13.1%~23.3%。

72.磷酸肌酸激酶同工酶电泳（CKIso）测定

【临床意义】

1.CK-MB升高心肌梗死患者CK-MB有规律的升高，心肌梗死发病后4~6小时开始升高，18~24小时达高峰，72小时内恢复正常。心脏术后、严重的冠心病、心肌炎、缺血性心脏病、杜兴肌营养不良、皮肌炎、多发性肌炎、肌红蛋白尿、横纹肌溶解等CK-MB也可升高。

2.CK-BB升高常见于脑外伤、新生儿窒息、脑膜炎、脑出血等脑损伤及前列腺癌，偶见于其他恶性肿瘤以及昏迷、慢性肾功能不全、肝豆状核变性、胃癌、肺癌和高热患者。

3.CK-MM升高生理性升高见于剧烈运动后。病理性升高见于外科手术后、肌营养不良、多发性肌炎、甲状腺功能减退等。

4.出现巨CK-Ⅰ 巨CK-Ⅰ是免疫球蛋白与CK-BB的复合物，目前无确定的病理意义，但据此可排除CK-MB的活性假性升高。

5.出现巨CK-Ⅱ 巨CK-Ⅱ是一种低聚的线粒体CK，又称CK-Mt，与恶性肿瘤相关，可作为肿瘤标志物。

【标本要求】

1.取静脉血3.0ml。分离后的血清2~8℃可保存1周。

2.避免使用肝素、EDTA、枸橼酸和含有氟化物、碘乙酸的抗凝管，因为这些物质可抑制肌酸激酶（CK）的活性。避免样本采集和处理过程的溶血，因为红细胞中的酶对CK的催化反应有干扰。

【方法与原理】

1.方法琼脂糖凝胶电泳法。

2.原理 CK有三种同工酶，分别是CK-MM（主要来自骨骼肌），CK-MB（主要来自心肌）和CK-BB（主要来自脑组织）。在一定的pH和离子强度条件下，这三种同工酶在琼脂糖凝胶中电泳的迁移率不同，从而分离、形成不同的条带，与CK试剂进行下列反应：

甲臜沉淀量与CK活力成正比例。

注：HK：己糖激酶；G-6-PDH：6一磷酸葡萄糖脱氢酶；ADP：5’-二磷酸腺苷；ATP：5’一三磷酸腺苷；NADP：辅酶Ⅱ；NADPH：还原型辅酶Ⅱ；PMS：吩嗪甲硫酸盐；PMSH：还原型吩嗪甲硫酸盐；TNBT：四氮蓝四唑

【仪器】

法国Sebia Hydrasys全自动凝胶电泳仪。

【试剂】

1.CK同工酶琼脂糖凝胶含琼脂糖0.8g/dl、碱性缓冲液pH8.40±0.05和叠氮钠0.10%。储存方法：包装盒的箭头向上水平放置，室温（15~30℃）或冷藏（2~8℃）保存，切勿冷冻。当胶面出现结晶、沉淀或可疑的细菌、真菌生长时，或胶盒内出现大量液体时，不能再使用。

2.缓冲条含碱性缓冲液pH8.3±0.1、0.2%叠氮钠。室温或冷藏保存，切勿冷冻。

3.激活液含缓冲液pH6.5±0.5，β-巯基乙醇7%。2~8℃保存，每次用完后，立即盖好，防止β-巯基乙醇被氧化。

4.底物溶剂含缓冲液pH6.70±0.15和添加剂。室温或2~8℃保存。

5.显色剂含溶解于二甲替甲酰胺（DMF）的TNBT。2~8℃保存。

6.CK同工酶底物含牛血清白蛋白、葡萄糖、ADP、NADP、己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、PMS、添加剂。2~8℃保存。

7.终止液含乙酸5%、枸橼酸0.5%。室温或2~8℃内保存。

8.加样梳。

9.薄滤纸。

10.厚滤纸。

11.质控血清 Bio-Rad Liquichek CK/LD同工酶质控血清。

【参数设置】

1.加样时间：10分钟

2.样品体积：10μl

3.电泳温度：20℃

4.电泳时间：6分钟

5.电泳电压：300V

6.电泳电流：3mA

7.电泳电压（V）、时间（h）乘积：27Vh

8.显色反应温度：37℃

9.显色反应时间：30分钟

10.终止反应温度：37℃

11.终止反应时间：10分钟

12.使用厚滤纸干燥温度：37℃

13.使用厚滤纸干燥时间：3分钟

14.胶片干燥温度：60℃

15.胶片干燥时间：2分钟

16.扫描仪波长：570nm

【操作步骤】

1.样品激活取血清样品500μl，加入激活液5μl，混匀，室温放置10分钟。

2.点样取激活样品10μl，点在样品加样梳上，将样品梳倒置插在保湿盒内，盖上保湿盒盖子，放置5分钟。每次测定要加一个质控血清。

3.电泳取蒸馏水250μl加于电泳仪平板的中下方，将凝胶片从包装袋中取出，平铺于电泳仪平板上（7人份置于平板中央），注意不要有气泡。用薄滤纸吸去凝胶表面残留水分，迅速揭掉滤纸。将电极条从包装袋中取出，分别固定在阴阳两个电极上。放下加样梳架，将加样梳保护架折断，插入6号位（7人份和15人份），盖上电泳仪盖。按1键，再按上下箭头选择项目7 ISO-CK（7人份），按回车键确认。按绿色执行键，开始电泳。

4.配制底物溶液电泳开始后，立即将底物冻干粉用2ml（7人份，绿帽小瓶，注明half）或4m1（15人份，白帽小瓶）底物溶剂溶解，混匀。电泳结束后，加入150μ，1（7人份）或300μl（15人份）显色剂，混匀。

5.加底物-显色液电泳结束后，仪器报警，液晶屏显示“Apply substrate”。取下加样梳架，将金属定位杆置于电泳板下方，定位杆标有“L”的一侧放在左手端，定位杆上的凹槽与电泳板上的定位柱相契合，将橙黄色（7人份）或黄色（15人份）加样板钩住定位杆的定位槽放在凝胶表面上。用加样枪取底物-显色液2ml（7人份）或4m1（15人份）加到加样板孔中，注意要将枪尖触到底，不能加入气泡。盖上电泳仪盖，按绿色执行键，开始孵育。

6.加终止液孵育结束后，仪器报警，液晶屏显示“↑SUB/↓ BLOCK”，用加样枪取出底物，并加入2ml（7人份）或4m1（15人份）终止液，按绿色执行键。

7.加盖厚滤纸去底色终止结束后，仪器报警，液晶屏显示“↑BLOCK/↓PAP”，用加样枪取出终止液，取下加样板，胶面上覆盖厚滤纸。盖上电泳仪盖，按绿色执行键。

8.干燥滤纸去底色结束后，仪器报警，液晶屏显示“↑PAPER+START”，按绿色执行键，开始干燥。

9.扫描干燥结束后，仪器报警，取下凝胶片，胶面朝下放在扫描仪的右上角。双击“Phoresis”图标，双击屏幕下方测定项目条框，选择Iso-ck。单击屏幕上方最右侧扫描仪图标，单击1号凝胶位选择胶片大小（7人份或15人份），按“开始扫描”，再按扫描。屏幕上出现凝胶片及红色线条的扫描轨迹，扫描轨迹必须通过需要扫描的区域。

10.曲线编辑按屏幕上方第三个图标，编辑扫描曲线，曲线上方为曲线编辑工具。

11.根据扫描结果出报告。

【性能参数】

1.精密度批内变异CK-MM为0.2%~1.0%，CK-MB为1.8%~5.6%，CK-BB为1.2%~1.3%；批间变异CK-MM为0~0.9%（平均为0.4%），CK-MB为2.7%~14.7%（平均为6.0%），CK-BB为1.2%~7.3%（平均为4.2%）。

2.准确度与另一个荧光检测CK同工酶的商品试剂盒进行比较研究，两者具有良好的相关性，CK-MB部分的相关系数为0.950。

3.灵敏度 CK-MB最低检测限为2.5IU/L。

4.线性范围 CK总活力20~750IU/L。

【参考范围】

CK-MM：97%~100%； CK-MB：0~3%； CK-BB：0%。

73.免疫固定电泳（IFE）测定

【临床意义】

用于诊断多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、原发性淀粉样变、轻链病、重链病和其他类型的单克隆免疫球蛋白血症，并可对其进行分型分析。

【标本要求】

1.空腹取静脉血3.0ml。

2.分离后的血清标本在室温稳定l天，2~8℃稳定10天，-20℃可保存1个月。

【方法与原理】每个经过稀释的血清样品先经过琼脂糖凝胶蛋白电泳进行分离，然后在六个不同泳道内分别加入蛋白固定液、抗γ重链、抗α重链和抗μ重链抗体以及抗κ轻链、抗入轻链抗体，样品中相应抗原与试剂中的抗体结合后沉淀，被固定于琼脂糖凝胶内。在进行蛋白染色前，先对电泳胶片进行冲洗，洗掉没有被固定的蛋白，然后再用酸性紫进行蛋白染色。对照泳道（所有血清蛋白都被固定）中出现的密集单克隆条带，可通过其他泳道内相同电泳位置是否出现密集条带，确定该单克隆蛋白的类型，如IgGK型、轻链λ型等。

【仪器】

美国Helena公司Spife Combo或4000型全自动电泳仪。

【试剂】

1.凝胶片琼脂糖凝胶，含Tris-巴比妥-MOPS缓冲液和叠氮钠防腐剂。

2.单克隆抗体抗人γ重链抗体（绿色），抗人α重链抗体（红色），抗人μ重链抗体（蓝色），抗人κ轻链抗体（橘红色）和抗人λ轻链抗体（蓝紫色），蛋白固定液（无色）。

3.质控血清包括IgGK、IgA入和IgM型血清。

4.酸性紫染料用1L 10%醋酸溶液溶解。

5.枸橼酸脱色剂将整袋脱色剂倒入桶中，加入11L蒸馏水，混匀，终溶液含枸橼酸0.3%。

6.Tris-Buffer NaCl 将整袋试剂倒入桶中，加入8ml蒸馏水，混匀。

7.白色加样板。

8.加样条。

9.加样梳。

10.自动点样器。

11.碳棒。

12.抗体模板。

13.凝胶铲。

【参数设置】

1.取样： 30秒 21℃

2.加样： 30秒 21℃

3.电泳： 6分30秒 21℃ 650V

4.抗体孵育： 10分钟 21℃

5.吸去多余抗血清： 2分钟 21℃

6.厚滤纸去底色： 5分钟 40℃

7.干燥： 8分钟 50℃

8.第一次冲洗： 3秒钟

9.第二次冲洗： 10分钟

10.染色： 4分钟

11.第一次脱色： 1分钟

12.第二次脱色： 1分钟

13.干燥： 8分钟 63℃

14.第三次脱色： 1分钟

15.干燥： 5分钟 63℃

【操作步骤】

1.稀释样品每个标本进行3倍和5倍稀释，即取样品50μl，分别加入100μl和200μl生理盐水。或可根据免疫球蛋白定量结果调整稀释倍数。

2.加样在加样板上，插入加样条，每个加样槽加入20μl稀释样品，每个样品的SP位置加3倍稀释血清，其他5个位置加5倍稀释血清。

3.放置凝胶取约2ml界面液，置于电泳板上。拆开凝胶包装，取出凝胶片，去掉胶面上覆盖的塑料薄膜，将凝胶片从中间向两边缓慢放在电泳板上，胶片上的定位孔与电泳板的定位柱相契合，注意凝胶片和电泳板间不能有气泡。用薄滤纸吸去凝胶表面的多余水分，立即揭去滤纸。

4.吸样加样板的两个定位柱靠近操作者，将自动点样器的控制按钮置于操作者一侧放置在点样板上，其定位卡口与加样板的定位柱相契合，将加样梳插入点样器的4、11和18号位（9人份）。在仪器右侧电泳控制台上选择测定项目IFE，按“Start/Stop”，再按“Start/Stop”，再按“Test select/Continue”，同时按下自动点样器的控制按钮，加样梳插入加样槽中开始吸样。

5.点样吸样完成后，仪器报警，抬起自动点样器的控制按钮。将自动点样器迅速转移至电泳板上，电泳板上的定位柱与点样器上的定位卡口相契合，迅速按下点样器控制按钮，同时按下仪器“Test select/Continue”键，加样梳插入凝胶中开始点样。

6.电泳点样完成后，仪器报警，抬起点样器控制按钮，并将点样器从电泳板上移开。将两只碳棒搭在电极柱的外侧，并与外侧胶面相接触，盖上电泳仪盖，按“Test select/Continue”键开始电泳。

7.加入质控血清电泳完成后，仪器报警，打开电泳仪盖，移开碳棒，用凝胶铲铲去两侧与碳棒接触的凝胶，在凝胶第一个样品位置的5个圆孔内分别加入1μl IgGκ、IgAγ和IgM型质控血清。

8.加入抗体固定将抗体模板轻轻放在胶面上，模板上的定位孔与电泳板上的定位柱相契合。用加样枪取各种抗体40μl，分别加入不同的电泳泳道（泳道右侧孔）。盖上电泳仪盖，按“Test select/Continue”键，开始孵育。

9.吸去多余抗体孵育完成后，仪器报警，将纸梳插入泳道右侧孔，盖上电泳仪盖，按“Test select/Continue”。

10.去除底色仪器报警，取下纸梳，移开抗体模板，用厚滤纸覆盖凝胶表面，并轻压。盖上电泳仪盖，按“Test select/Continue”。

11.干燥仪器报警，取下厚滤纸，按“Test select/Continue”，开始干燥。

12.冲洗、染色、脱色干燥结束后，仪器报警，将凝胶片从电泳板上取下，夹在胶片夹上，插入染色池。在左侧工作台上按“Test select/Continue”按钮，选择“Serum IFE”。按“Start/Stop”，再按‘‘Start/Stop”，按‘‘Test select/Contin-ue”，开始冲洗和染色程序。

13.读片工作完成后，仪器报警。取出凝胶片，读片出报告。质控样品的5个圆孔边缘应出现蓝紫色的免疫沉淀物，该次测定才算有效。

14.结果读取方法重链泳道和轻链泳道在相同的迁移距离处出现密集的条带，为完整的M蛋白；若只有轻链泳道出现密集条带，为轻链型；若无密集条带，为阴性。

注意：若轻链出现单克隆条带，而重链IgG、IgA、IgM均未出现单克隆条带，则需重复测定该标本，用抗IgD和IgE重链的抗体进行固定。

74.尿蛋白电泳（UPE）测定

【临床意义】

电泳将尿中不同分子量大小的蛋白进行分离，通过确定尿中蛋白质的分子量大小判定肾脏损伤的部位和性质。

1.生理性蛋白尿尿蛋白含量很低，通常低于120mg/24h，男女之间无明显差异。主要是白蛋白，有时可有极微量的转铁蛋白或免疫球蛋白。

2.肾小球型蛋白尿尿蛋白特征为分子量＞65~70kDa（如白蛋白、转铁蛋白和IgG），白蛋白是其主要组分。出现肾小球型蛋白尿提示肾小球滤过功能损害。若大部分为中分子蛋白如白蛋白、转铁蛋白等，为选择性蛋白尿；若大部分为大分子蛋白如IgG、IgA等，则为非选择性蛋白尿；尿中出现异常量的白蛋白是糖尿病肾病的早期诊断指标。

3.肾小管型蛋白尿其蛋白特征为分子量＜65~70kDa，如α₁-微球蛋白、游离轻链单体、β₂微球蛋白、视黄醇结合蛋白（RBP）及溶菌酶，单纯性肾小管型蛋白尿中白蛋白只占少部分。出现肾小管型蛋白尿提示肾小管的重吸收功能受到损害。某一种蛋白大量出现在尿中，提示为溢出性蛋白尿，如多发性骨髓瘤患者尿中出现大量游离轻链，白血病患者尿中出现大量溶菌酶等等。

4.混合型蛋白尿其蛋白特征为肾小管及肾小球的蛋白同时并存。提示肾小管和肾小球都有损伤。

【标本要求】

留取晨尿5~10ml，2~8℃可保存一周，不可冻存。

【方法与原理】

1.方法 SDS琼脂糖凝胶电泳。

2.原理样品先用阴离子表面活性剂一十二烷基磺酸钠（SDS）进行处理，使得样品中各种不同的蛋白质表面带过量的负电荷，然后在5%的琼脂糖凝胶上进行电泳。样品中的蛋白质由阴极向阳极泳动，其迁移率取决于分子量的大小，分子量越小，迁移率越大，位置越靠近阳极；分子量越大，迁移率越小，位置越靠近阴极。因此，尿蛋白最终的电泳谱带，从阴极向阳极按照分子量由大到小的顺序排列。中等大小（65~70kDa）的白蛋白位于谱带中央；大分子的蛋白（＞65~70kDa）位于白蛋白的阴极侧，和白蛋白一起被称为肾小球性蛋白；小分子的蛋白（＜65~70kDa）位于白蛋白的阳极侧，被称为肾小管性蛋白。如果在凝胶上同时做一个分子量的Marker，则可大致确定各蛋白条带的种类，如转铁蛋白、β₂微球蛋白等等。

【仪器】

法国Sebia公司Hydrasys凝胶电泳仪。

【试剂】

1.琼脂糖凝胶含琼脂糖5g/dl，中性缓冲液pH7.0±0.1，十二烷基磺酸钠（SDS）。室温平放保存，不得冷藏或冷冻。

2.缓冲条缓冲海绵条，含pH6.9±0.1的中性缓冲液，SDS。室温保存。

3.酸性结晶紫染液浓缩结晶紫染液内加蒸馏水或去离子水稀释至300ml。稀释后此工作染液为pH2.0的酸性溶液，含结晶紫0.2g/dl，乙烯乙二醇3.25%。室温保存。

4.样品稀释液含中性缓冲液pH7.0±0.3，SDS，溴酚蓝。室温保存。

5.滤纸用于在加样前吸去凝胶片表面过多的水分。

6.脱色液 5ml冰醋酸加蒸馏水稀释至51。

7.封片液15%的甘油水溶液200ml，新鲜配制。

8.分子量Marker 包括14.3kDa（溶菌酶）、26.6kDa（游离轻链）、66kDa（白蛋白）和150kDa（人IgG）。

【参数设置】

1.样品量： 5μl

2.样品扩散： 20.0℃ 10分钟

3.电泳： 300V 15分钟 20.0℃

4.胶片干燥： 45分钟 20℃

5.染色： 15分钟

6.第一次脱色： 25分钟

7.第二次脱色： 15分钟

8.第三次脱色： 5分钟

9.甘油封片： 15分钟

10.清洗： 1分钟

11.干燥： 10分钟

【操作步骤】

1.标本处理取20μl样品稀释液，加入试管底部。注意：该稀释液很黏稠，必须缓慢吸取，并缓慢打出，不要吸进气泡。再加80μl尿标本，混匀，室温放置5分钟。尿总蛋白浓度超过2000mg/L，需要对标本进行稀释。浑浊标本，推荐3000转/分钟离心10分钟，取上清液进行分析。

2.加样拆开凝胶片包装，取出凝胶片平放在黑色垫板上，用加样器吸取处理过的尿标本5μl，加样器枪头与凝胶呈45°斜插入样品槽一侧，打出样品，注意不要触及槽孔底部，不要加入气泡。在其中的一个孔内加入分子量Marker作为质控。

3.电泳

（1）打开仪器电源，按“1”键，再按上下箭头选择“PROTEINURIA 1×5”程序（5人份）“或Proteinuria 2×5”（10人份）。

（2）打开电泳室盖，掀起加样梳架，在电泳室温度控制板正中下方（5人份）或分别在两边（10人份）点上250μl蒸馏水，将凝胶片缓慢地由下至上平铺于温度控制板上，注意不要有气泡。

（3）从包装中取出缓冲条，握住其两端塑料衬垫部分，将其两孔固定在电极架上的两个栓上，缓冲条塑料衬垫物的背必须贴紧电极架。

（4）放下加样梳架，盖上电泳室盖，按电泳侧的绿色执行键，开始电泳。

4.染色电泳完成后，仪器报警。打开电泳室盖，掀开加样梳架，取下凝胶片，打开胶片夹，将湿凝胶片面朝向上平放在胶片夹两根支杆的槽中，合上胶片夹，将其插入染色池中。按“3”，在菜单中选择染色程序“Proteinuria”，按绿色执行键，开始染色、脱色、封片、干燥。

5.扫描染色完成后，仪器报警，将凝胶片从胶片夹上取下，胶面朝下放在扫描仪的右上角。双击“Phoresis”图标，双击屏幕下方测定项目条框，选择Pro-teinuria。单击屏幕上方最右侧扫描仪图标，单击1号凝胶位选择胶片大小（7人份），按“开始扫描”，再按扫描。屏幕上出现凝胶片及红色线条的扫描轨迹，扫描轨迹必须通过需要扫描的区域。

6.曲线编辑按屏幕上方第三个图标，编辑扫描曲线，曲线上方为曲线编辑工具。

7.出报告根据分子量Marker的位置大致判断患者尿标本中蛋白质的种类，以白蛋白为界，白蛋白阳极侧的为分子量较小的蛋白，属于肾小管性蛋白；白蛋白及其阴极侧的蛋白为分子量较大的蛋白，属于肾小球性蛋白。

【性能参数】

1.灵敏度最低蛋白条带检出限50mg/L。

2.重复性同一块凝胶板，同一批号不同的凝胶板，不同批号的凝胶板，测定结果无明显差异。

3.准确性与蛋白定量测定试验符合率为80%。

75.尿免疫固定电泳（UIFE）测定

【临床意义】

一些血液中出现单克隆免疫球蛋白的疾病如多发性骨髓瘤、原发性淀粉样变和POEMS综合征等的患者，其B细胞可以分泌过量轻链，这些轻链不能与重链组成完整的免疫球蛋白而进入尿中，形成单克隆的游离轻链，被称为本一周蛋白。本一周蛋白是血液中存在M蛋白的重要证据。

【样本要求】

1.晨尿，清洁中段尿。

2.2~8℃可保存一周，-20℃以下可保存至少1个月。

【方法与原理】

1.方法免疫固定电泳。

2.原理尿液中的蛋白在琼脂糖凝胶中进行电泳分离，每一个尿液标本加入6个电泳泳道中，电泳完成后在每个泳道中加入不同的抗血清，第一泳道加入蛋白固定液，此泳道作为参比；第二泳道：抗γ链（IgG重链）、α链（IgA重链）和μ链（IgM重链）的混合抗血清；第三泳道：抗.c链（包括游离和结合）抗血清；第四泳道：抗λ链（包括游离和结合）抗血清；第五泳道：抗游离K链抗血清；第六泳道：抗游离入链抗血清。抗原和抗体反应形成抗原一抗体复合物沉淀在凝胶内，凝胶片经过冲洗，没有结合的蛋白质被清洗掉。凝胶片经过蛋白染色后，和抗体结合的蛋白被染色。根据蛋白条带是否密集，判断尿液中是否存在单克隆的免疫球蛋白；根据该蛋白在不同泳道被固定的情况，判断该蛋白的性质：是否为完整的免疫球蛋白，还是游离轻链（即本一周蛋白）。

【仪器】

法国Sebia公司Hydrasys凝胶电泳分析仪。

【试剂】

1.尿免疫固定电泳琼脂糖凝胶试剂盒，室温保存至有效期。

（1）琼脂糖凝胶：含琼脂糖凝胶0.8g/dl，Tris-巴比妥缓冲液pH9.1±0.1和添加剂。室温（15~30℃）或冰箱（2~8℃）保存在原密封袋内，按包装盒上箭头方向水平放置。不要放置在靠近窗户和热源的地方，环境温度不要剧烈变化，不要冷冻。

（2）缓冲条：含Tris-巴比妥缓冲液pH9.1±0.3、叠氮钠和添加剂。室温（15~30℃）或冰箱（2~8℃）保存在原密封袋内，按包装盒上箭头方向水平放置。不要冷冻。

（3）酸性紫染液（75ml）：使用前将储存液用蒸馏水稀释至300ml，酸性紫染液终浓度为0.2g/dl，pH2.0，乙二醇3.25%。储存液和工作液室温或冰箱（2~8℃）保存，工作液可稳定6个月。

（4）加样梳：18齿加样梳，室温干燥保存。

（5）薄滤纸：室温干燥保存。

（6）厚滤纸：室温干燥保存。

2.抗血清和蛋白固定液试剂盒：冰箱（2~8℃）保存。

（1）蛋白固定液（1.0ml），黄色。

（2）哺乳动物抗人重链抗血清（1.0m1）：紫色。抗γ链（IgG重链）、抗α链（IgA重链）和抗μ链（IgM重链）混合抗血清。

（3）哺乳动物抗人轻链K抗血清（1.0m1）：绿色。

（4）哺乳动物抗人轻链λ抗血清（1.0ml）：蓝色。

3.本一周蛋白抗血清试剂盒：冰箱（2~8℃）保存。

（1）哺乳动物抗人游离轻链.c抗血清（1.0m1）：橘黄色。

（2）哺乳动物抗人游离轻链入抗血清（1.0ml）：红色。

4.脱色液储存液5ml加蒸馏水至5L，枸橼酸终浓度为0.5g/L。储存液置于室温或冷藏保存，可在有效期内稳定；工作液在室温稳定1周。自配脱色液：取冰醋酸5ml加水至5L。

5.清洗液储存液80ml加蒸馏水至5L，工作液含碱性缓冲液（pH8.8±0.3）和叠氮钠，可在有效期内稳定。自配清洗液：取lOg枸橼酸钠溶于5L蒸馏水中。

【操作步骤】

1.参数设置

（1）电泳程序：2/4 BJ-UP MS/MD（4人份），9 BJ MS（9人份）

（2）电泳条件：20W电泳9分钟（42Vh）（4人份），20W电泳7分钟（36Vh）（9人份）

（3）电泳温度：20℃

（4）抗血清体积：12μl（4人份），8μl（8人份）

（5）抗体孵育温度：20℃

（6）抗体孵育时间：10分钟

（7）吸去抗血清温度：40℃

（8）吸去抗血清时间：3分钟

（9）电泳后干燥温度：50℃

（10）电泳后干燥时间：6分钟

（11）染色和脱色程序：IF ACID VIOLET

2.操作步骤

（1）打开电泳仪电源，按数字1键，用上下箭头键选择测定项目“2/4 BJ-UPMS/MD”（4人份）或“9 BJ MD”（9人份），按回车键确定。

（2）点样：4人份为15齿加样梳，每两个标本用一个加样梳。空出第1、8、15位，一个标本连续加入6个加样孔，一孔加10μl样品。9人份为18齿加样梳，每三个标本用一个加样梳。将加样梳倒置放人保湿盒中，保持5分钟。

（3）凝胶准备：将凝剂片的包装撕开，将凝胶取出平放在塑料包装盒上，用薄滤纸吸去凝胶上的多余水分，迅速将滤纸揭开。

（4）在凝胶板中间靠下的位置滴250μl蒸馏水，两只手抵住凝胶片左右两侧将凝胶下缘顶在凝胶板的底部边框上（注意不要触碰凝胶），将其由下至上缓慢地放置在凝胶板上，注意不要产生气泡。

（5）拆开缓冲条包装，将缓冲条吊在电泳架内侧的两个电极上，令其突出的一边朝向凝胶。

（6）放下电泳架，将加样梳的保护架折断，将其插入3号和9号位（4人份）或2、6、10号位（9人份），并推向最右侧。

（7）盖上电泳室盖子，按左侧绿键开始电泳。

（8）电泳结束后，仪器报警，并显示“↓AS”，将电泳室盖掀开，取下加样梳，掀起电泳架，卸下电极条，并把整个电泳架取下。

（9）安装抗血清涂布装置：将灰色（4人份）或蓝色（9人份）的抗血清注加条（一次性使用）的两个突起对准塑料架子的切口并呈45°，将注加条向上翻转使其嵌入塑料架子（注意一定要完全嵌入，安装结束后可拉动注加条，观察有无晃动），将塑料架子放在方形引导架上。

（10）在电泳板下方放置金属定位杆，再将抗血清涂布装置安装在定位杆上。

（11）加抗血清：在涂布装置上方放置彩色参比板，按照参比板的颜色加入抗血清。在每个标本对应的抗血清注加条中，从左至右分别加入蛋白固定液（黄色）、抗GAM重链抗血清（紫色）、抗轻链κ抗血清（绿色）、抗轻链入抗血清（蓝色）、抗游离轻链K抗血清（橘黄色）和抗游离轻链λ抗血清（红色），每个孔加入抗血清12μl（4人份）或8μl（9人份），操作时沿孔壁缓慢加入，不要有气泡。

（12）涂布抗血清：轻轻按压抗血清涂布装置的塑料架中部，使其与胶面接触，然后轻轻抬起，孔内液体漏出到胶面上，沿引导架匀速上推涂布装置手柄至凝胶顶部，再匀速返回。注意：如有个别孔内液体未漏出，可再轻按该孔所在一侧促其漏出。

（13）抗体孵育：将引导架上的塑料架取下，盖上电泳室盖，按绿键开始孵育。

（14）孵育完成后，仪器报警，并显示“↓PAP”。打开电泳室盖，取下引导架和定位杆，将厚滤纸覆盖到胶面上，并轻轻按压。盖上电泳室盖，按绿键继续。

（15）吸水完成后，仪器报警，并显示“↑PAP”。打开电泳室盖，取下滤纸。盖上电泳室盖，按绿键干燥。

（16）干燥完成后，仪器报警。打开电泳室盖，取下胶片。

（17）将胶片夹到胶片夹上，插入染色槽。

（18）按数字键3，用上下箭头选择染色程序“IF ACID VIOLET”，再按回车键确认。

（19）检查染液、脱色液和洗液体积，按右侧绿键开始染色。

（20）染色完成后，仪器报警。

（21）读片，出报告。

3.结果读取方法

（1）本-周蛋白阳性：轻链κ或λ泳道出现窄细条带，在相同电泳位置，游离轻链κ或λ泳道亦出现窄细条带；GAM抗血清泳道没有条带。

（2）本-周蛋白阴性，血清中的单克隆免疫球蛋白进入尿中：GAM抗血清泳道出现窄细条带，在相同电泳位置，轻链K或入泳道亦出现窄细条带，而游离轻链κ或入泳道不出现条带。

（3）本-周蛋白阳性，血清中的单克隆免疫球蛋白进入尿中：GAM抗血清泳道出现窄细条带，在相同电泳位置，轻链.c或入泳道亦出现窄细条带；同时，轻链κ或λ泳道出现第二条窄细条带，在相同电泳位置，游离轻链K或入泳道亦出现窄细条带。

（4）聚合的本-周蛋白阳性：GAM抗血清泳道没有条带；轻链K或入泳道出现数个窄细条带；游离轻链K或λ泳道出现一条窄细条带，且与前者某一个条带处于同一位置。

【性能参数】

1.精密度一个病理标本在一个凝胶片上做4次（4人份）或9次（9人份），做两个批号，此为胶内重复性；三个病理标本在10个凝胶片上做10次，做三个批号，此为胶间重复性。结果均可重复。

2.准确度和已上市的免疫固定电泳试剂盒进行比对，36份病理性尿标本和5份正常人标本的结果一致。

3.灵敏度最低检测限3mg/L（总轻链）和12mg/L（游离轻链）。

76.普通血栓弹力图（TEG）实验

【临床意义】

图1-7横坐标为时间，纵坐标为血块强度。

1.R值（分钟）为从血样开始检测至描记图开口幅度达2mm所需要的时间。该参数反映凝血因子连续激活形成纤维蛋白的时间长短，R值延长表示凝血因子缺乏或正在进行抗凝治疗（如使用肝素或华法林），R值缩短表示凝血因子活性增强。

2.K值（分钟）为从R时间终点至描记图幅度达20mm所需时间。该参数反映的是血块形成初期纤维蛋白原与血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa结合，引起血小板聚集，以及纤维蛋白原转化为纤维蛋白后相互聚合和交联的过程，因此κ值大小主要反映纤维蛋白原水平及其功能状态，κ值延长表示纤维蛋白功能和水平降低，κ值缩短表示其功能增强或水平升高。同时K值也受凝血因子活性和血小板功能的影响，R值延长和MA值减少，都可以造成K值延长。

3.Angle角（度）为从血凝块形成点至描记图最大曲线弧度作切线与水平线的夹角与K值相同，但当处于极度低凝状态时（描记图开口幅度达不到20mm时），该参数更敏感。Angle角减小表示纤维蛋白功能和水平降低，Angle角增大表示其功能增强或水平升高。

4.MA值（mm）为描记图的最大幅度，即最大切应力。MA反映形成血凝块的最大强度或硬度及其稳定性，它主要受纤维蛋白原和血小板两个因素的影响，其中血小板的数量和质量是主要影响因素（80%），因此MA值反映血小板的数量和功能，MA值升高表示血小板数量增加或功能增强，反之则表示血小板数量减少或功能降低。

5.CI值为凝血综合指数，它是根据R，K，Angle角，MA值推算出来的反映整体凝血功能的参数，CI=0.2454R+0.0184K+0.1655MA-0.0241a-0.0220。CI值＜-3提示低凝，容易出血；CI值＞3提示高凝，容易形成血栓。

6.A值（mm）任一时刻描记图的幅度，是反映任一时刻血凝块强度和弹性的参数。

7.LY30（%）MA值确定后30分钟血凝块溶解的百分比，该参数反映纤溶系统功能，升高表示纤溶亢进，当CI值＜3时为原发纤溶亢进，CI值＞3时为继发纤溶亢进。

8.EPL（%）预测在MA值确定后30分钟血凝块将要溶解的百分比，EPL=100（MA-A30）/MA，意义与LY30相同。

9.SP值（分钟）为从反应开始到弹力图曲线出现分叉的时间，是纤维蛋白原激活前的时间，反映凝血因子活性。

10.G值（d/sc）是血凝块强度的力学表述，即最大切应力强度，由A值转换而来，G= 5000A/（100-A）。MA值确定后，该值确定，与MA值意义相同。

11.E值（d/sc）是标准化的G，弹性常数。MA值确定后，E= （100×MA）/（100-MA），与MA值意义相同。

12.LTE（分钟）是血块溶解时间的估计值。在MA出现后30秒电脑开始计算LTE，并不断更新直到MA出现后60分钟。如果血块在60分钟之前已溶解，此时LTE为实际血块最终溶解时间。如果LTE大于3小时，该值显示“＞3hrs”。LTE是根据弹力图的斜率并外推到振幅为2mm计算得到。LTE是纤溶的预测指标，缩短表示纤溶亢进。

13.TMA值（分钟）为测定开始到MA值确定所需时间，是反映血凝块动力学特性的综合指标，包括血凝块形成速率和形成稳定血凝块所需时间。

14.TPI值（/sec）为血小板动力学指数，TPI= E/K，描述患者枸橼酸化全血的血凝情况。

【样本要求】

1.枸橼酸钠抗凝全血3.0ml，血液不能出现凝块。

2.全血标本可在室温（20~25℃）保存2小时。

【方法与原理】

承载血标本的测试杯以4。45'的角度和每9秒一周的速度均速转动，一旦血栓形成，置于血标本检测杯中的金属探针受到血块的切应力作用，随之出现左右旋动，金属针在旋动过程中由于切割磁力线而产生电流，被电脑软件处理后，便形成TEG曲线。

【仪器】

1.水平仪调平分析仪的标准。

2.电源按钮打开或关闭电源。

3.加温线传递温控模块的信号。

4.杯槽装载样品并进行加热。

5.水平调节支撑旋转以调平分析仪。

6.马达按钮按压后马达运行，并有黄灯显示。

7.控制杆可移动到LOAD、TEST、EJECT三个位置。

8.杯架用来上下移动样品。

9.平台用来弹出样品。

【试剂】

1.高岭土激活剂（25个测试/盒）2~8℃冰箱保存，不得冻存，试剂在有效期内保持稳定。

2.0.2mol/L CaCL2 2~8℃冰箱保存。

3.TEG普通测试杯（白色，20个/盒） 25~30℃保存。

4.TEG1水平质控（12套/盒）含蒸馏水，冻干1水平质控品和氯化钙。

5.TEG2水平质控（12套/盒）含蒸馏水，冻干2水平质控品和氯化钙。

【操作步骤】

1.按TEG分析仪上的Power键，打开电源。

2.查看TEG分析仪顶部水平仪，将水平仪内的气泡置于中央，若不在中央，可以调节主机底部三个支脚。

3.从Windows桌面双击TEG软件图标TE6®启动程序。

4.按User name下拉列表，选择Site Administrator，输入密码teg，按OK登录。

5.选择Temporary Operator，按I.og on键。

6.按TEG键，再按Check now键进行eTest（每天新开机时），或按Skiptest键（一天之内再开机时，可跳过eTest）。

7.将TEG分析仪某个通道正对操作者的操作杆（Lever杆）向右拨到测定位置，并在操作软件上，将光标移至该通道，按eTest键开始仪器测试。仪器测试结束后，在该通道上显示“eTest is OK”，表示测试通过。在操作软件上按Done键，软件提示操作者将操作杆拨回原位（Load位），完成此操作后按OK。

8.按Case键，输入患者ID号、姓名、性别和年龄。按Add another键编辑一个新标本或Done键结束编辑。

9.按TEG进入测定程序。在选择的某个通道上通过下拉列表选择患者姓名，测定项目选CK。

10.在TEG分析仪的相应通道上，安装普通测试杯。将白色的杯架沿着杯杆往下滑到底部平台上，让操作杆位于Load位置，当操作杆位于测试位时，请勿装杯。将杯子连同杯盖一起放入杯槽内，然后将杯架滑到杯杆顶部直到滑不动为止。一只手放在分析仪顶部，另一只手按住杯架底部的按钮，连续向上按三次，确保金属针插入杯盖。然后将杯架往下滑到杯杆中部，两手扶住杯架，并用大拇指将杯子压入杯槽中，上杯完成。

11.在测试杯中加入20μl CaCI2溶液。打开高岭土试剂瓶盖，反复混匀枸橼酸抗凝全血，向瓶中准确注入Iml全血，颠倒混匀，并保持1~2分钟，然后取340μl激活全血注入测试杯中，为防止出现气泡，应将加样器管尖置于液面下。

12.立即将杯架上滑到杯杆顶部，然后将操作杆向右拨到测试位，同时在测试程序上点击“Start”开始测定，通道由蓝色变为激活状态的绿色。

13.按“Done”退出操作界面，双击该测试图形，将图形放大。

14.当图形下的所有测试参数数值都没有*时测试完成，点击“Stop”结束运行，在弹出的对话框中点击“Yes”，将操作杆拨至Load位，并将其向下压三下，将杯盖从上方压回杯内。然后将杯架滑到杯杆中部，用示指向上顶杯架底部的按钮，将测试杯从杯槽中顶出，并取出扔掉。

15.当光标处于该测试图形时，点击“Report”，在“Graphics options“选项下选中“Clot”、“Grid lines”和“Print text in black”，在“Numeric options”选项下选中“All tests”，在“Sample options”选项下选中“Selected sample（s）（currently l）”，再点击“Continue”→“Print”，打印图形报告。

16.当光标处于该测试图形时，点击屏幕左上角的“File”，选择“Export”→选中“Single tracing”→点击“Next＞”→“Next＞”，输入文件名，点击“保存”。在联众Lis系统的数据传输对话框上点击“打开文件”，选择该文件后点击“接收”，数据即进入Lis系统。注意：分析程序中患者的ID号要和Lis系统中该患者的ID号一致。

17.质控和普通标本一样，分别运行质控1和质控2，将测量数值与给定范围进行比对，若在此范围内，则表示质控通过。

【性能参数】

1.精密度总变异（n＝40，测试时间5天），R值8.7%，K值7.6%，ANG角2.4%，MA值4.1%。

2.准确度将TEG5000型分析仪和TEG3000型分析仪的测定结果进行对照，结果见表1-3。结果显示当P＜0.05时，5000系列和3000系列TEG参数测定值差异没有统计学意义，且两者的绝对差值没有超出仪器精确程度允许的误差范围，说明两者的分析结果一致。

【参考范围】

R值7.0~13.0分钟，K值3.0~5.0分钟，ANG角61.0°~73.0°，MA值55.0~65.0mm9n-98。

表1-3 TEG5000型和TEG3000型分析结果对比（n＝40）

参数
R（min）	K（min）	Angle（deg）	MA（mm）
5000型（测定结果±标准偏差）	11.5 6 2 5 1：1.17 80	2.1500+0.3790	73.9625±2.3820	30.6250±1.0360
3000型（测定结果±标准偏差）	11.7500±1.2760	2.2750±0.4230	73.3750±3.0610	30.4010±1.2610
测定结果差别（测定值差值士标准偏差）	0.1875±0.3540	0.1250±0.0900	0.5875±0.6130	0.2240±1.4980
T值	0.68	1.39	0.96	0.87
DF	78	78	78	78
2-TAIL P值	0.497	0.168	0.341	0.388

77.TEG肝素酶实验

【临床意义】

1.与普通TEG实验联合使用，可以对肝素和低分子肝素进行监测。肝素适宜量：普通TEG实验中的R值是TEG肝素酶实验中的R值两倍。

2.去除血样中的肝素污染。

【样本要求】

1.枸橼酸钠抗凝全血3.0ml。

2.全血标本可在室温（20~25℃）保存2小时。

【方法与原理】

仪器原理与普通血栓弹力图（TEG）实验相同。血液中的外源性肝素被肝素酶中和后的血栓弹力图实验。

【仪器】

与普通血栓弹力图（TEG）实验相同。

【试剂】

1.高岭土激活剂（25个测试/盒）2~8℃冰箱保存，不得冻存，试剂在有效期内保持稳定。

2.0.2mol/LCaCl₂ 2~8℃冰箱保存。

3.TEG肝素酶测试杯（蓝色，20个/盒）含黄杆菌中提取的冻干肝素酶Ⅰ2.0IU，可中和6.0IU的肝素，2~10℃塑料袋密封保存可稳定至有效期。

【操作步骤】

1~7步与TEG普通测定相同。

8.按TEG进入测定程序，在某一通道上通过下拉列表选择患者姓名，测定项目选CKH。

9.在TEG分析仪的相应通道上，如普通TEG实验中的第9步安装肝素酶测试杯，注意肝素酶杯要复温半小时。

10~15步与普通TEG实验相同。

【参考值范围】

与普通TEG实验相同。

78.TEG血小板图实验（ADP途径）

【临床意义】

该实验反映血小板的ADP激活途径被抑制的程度，可对抗血小板药物氯吡格雷（波立维）等进行监测。抑制率达75%以上，说明波立维对血小板功能具有良好的抑制作用；抑制率达50%以上，说明波立维对血小板功能有抑制作用；抑制率低于20%，说明该患者对波立维不敏感（波立维抵抗）或剂量不够。

【样本要求】

1.枸橼酸钠抗凝全血3.0ml，肝素锂抗凝血5.0ml，血液不能出现凝块。

2.全血标本可在室温（20~25℃）保存2小时。

【方法与原理】

仪器原理与普通血栓弹力图（TEG）实验相同。

实验原理如下：

1.抗血小板药物氯吡格雷（波立维）是一种血小板聚集抑制剂，它通过不可逆地修饰血小板的二磷酸腺苷（ADP）受体而选择性抑制ADP与其血小板受体的结合，进而抑制ADP介导的糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物的活化，从而抑制血小板聚集。

2.TEG血栓弹力图实验可以通过MA值测定血小板功能，并通过三种试剂经不同的激活通路使血小板激活，来测定抗血小板药物对血小板功能抑制作用的大小，进而确定药物是否起效或药物剂量是否合适。

3.第一通道：激活剂为高岭土，连续的酶促反应使凝血酶激活，进而激活纤维蛋白原和血小板，此时测定的MA值（MAKH）为全部血小板和纤维蛋白（原）对血块弹性的贡献；第二通道：激活剂为爬虫酶（激活剂F），可不通过凝血酶激活纤维蛋白原形成纤维蛋白，进而形成交联的纤维蛋白。此时测定的MA值（MAF）为纤维蛋白（原）对血块弹性的贡献。第三通道：激活剂为二磷酸腺苷（ADP），可通过ADP途径激活血小板，此时测定的MA值（MAADP）为该途径激活的血小板对血块弹性的贡献。

【仪器】

与普通血栓弹力图（TEG）实验相同。

【试剂】

1.TEG血小板图试剂盒（ADP）包括一个高岭土激活剂以及激活剂F（红盖）、二磷酸腺苷（ADP，白盖，终浓度为2μmol/L）和蒸馏水（绿盖，750μl）各一瓶，TEG普通测试杯三个。该试剂盒2~8℃冰箱保存，试剂复溶后室温稳定1小时。

2.0.2mol/L CaCl₂ 2~8℃冰箱保存。

【操作步骤】

1~7步与TEG普通测定相同。

8.按TEG进入测定程序。在第一通道上通过下拉列表选择患者姓名，测定项目选CK；第二通道上通过下拉列表选择患者姓名，测定项目选A-A；第三通道上通过下拉列表选择患者姓名，测定项目选ADP。

9.在三个通道上如普通测试安装测试杯。

10.在第一通道上按照TEG普通测定的10~11步进行操作。

11.取试剂盒中的蒸馏水50μL溶解激活剂F，水平摇动混匀；另取试剂盒中的蒸馏水100μl溶解ADP，颠倒混匀。

12.分别在第二和第三通道的测试杯中，加入10μl激活剂F溶液；第三通道的测试杯中再加入10μl ADP溶液。

13.将肝素锂抗凝全血颠倒混匀数次，然后在第二通道测试杯中加入360μl全血，反复吸取两次与试剂混匀，注意管尖不要高出液面，以免出现气泡。此时光标位于第二通道，在测定程序中按“Start”，开始描记图谱。

14.将肝素锂抗凝全血颠倒混匀数次，然后在第三通道测试杯中加入360μl全血，反复吸取两次与试剂混匀。此时光标位于第三通道，在测定程序中按“Start”，开始描记图谱。

15.对第一通道的测定结果进行TEG普通测定的第12~15步操作。

16.接“Muti”键，顺序点击第一通道、第二通道和第三通道测定图形，再按“Done”，将三个图形重叠，并计算出ADP途径抑制率，并按TEG普通测定的第14步打印图形报告。

17.按TEG普通测定的第13步结束实验并将测试杯取出。

【性能参数】

将血小板抑制剂Reopro加入8份志愿者血中，按照NCCLS EP15-P文件要求，每份标本测定4次，MA值批内精密度为CV 9%，总精密度为CV 10%。

79.TEG血小板图实验（花生四烯酸途径）

【临床意义】

该实验反映血小板的花生四烯酸激活途径被抑制的程度，可对抗血小板药物阿司匹林等进行监测。抑制率达75%以上，说明阿司匹林对血小板功能具有良好的抑制作用；抑制率达50%以上，说明阿司匹林对血小板功能有抑制作用；抑制率低于20%，说明该患者对阿司匹林不敏感（阿司匹林抵抗）或剂量不够。

【样本要求】

1.枸橼酸钠抗凝全血3.0ml，肝素锂抗凝血5.0ml，血液不能出现凝块。

2.全血标本可在室温（20~25℃）保存2小时。

【方法与原理】

抗血小板药物阿司匹林抑制环氧化物酶，使血小板膜上的花生四烯酸代谢不能完成，进而抑制血栓烷的形成和血小板聚集。

1.TEG血栓弹力图实验可以通过MA值测定血小板功能，并通过三种试剂经不同的激活通路使血小板激活，来测定抗血小板药物对血小板功能的抑制作用的大小，进而确定药物是否起效或药物剂量是否合适。抗血小板药物阿司匹林抑制环氧化物酶，使血小板膜上的花生四烯酸代谢不能完成，进而抑制血栓烷的形成和血小板聚集。

2.TEG血栓弹力图实验可以通过MA值测定血小板功能，并通过三种试剂经不同的激活通路使血小板激活，来测定抗血小板药物对血小板功能的抑制作用的大小，进而确定药物是否起效或药物剂量是否合适。

3.第一通道：激活剂为高岭土，连续的酶促反应使凝血酶激活，进而激活纤维蛋白原和血小板，此时测定的MA值（MAKH）为全部血小板和纤维蛋白（原）对血块弹性的贡献；第二通道：激活剂为爬虫酶（激活剂F），可不通过凝血酶激活纤维蛋白原形成纤维蛋白，进而形成交联的纤维蛋白。此时测定的MA值（MA_F）为纤维蛋白（原）对血块弹性的贡献。第三通道：激活剂为花生四烯酸（AA），可通过花生四烯酸途径激活血小板，此时测定的MA值（MAAA）为该途径激活的血小板对血块弹性的贡献。

【仪器】

与普通血栓弹力图（TEG）实验相同。

【试剂】

1.TEG血小板图试剂盒（AA）包括一个高岭土激活剂以及激活剂F（红盖）、花生四烯酸（AA，蓝盖，终浓度为Immol/L）和蒸馏水（绿盖，750μl）各一瓶，TEG普通测试杯三个。该试剂盒2~8℃冰箱保存，试剂复溶后在室温可稳定1小时。

2.0.2mol/L CaCl2 2~8℃冰箱保存。

【操作步骤】

1~7步与TEG普通测定相同。

8.按TEG进入测定程序。在第一通道上通过下拉列表选择患者姓名，测定项目选CK；第二通道上通过下拉列表选择患者姓名，测定项目选A-A；第三通道上通过下拉列表选择患者姓名，测定项目选AA。

9.在三个通道上如普通测试安装测试杯。

10.在第一通道上按照TEG普通测定的10~11步进行操作。

11.取试剂盒中的蒸馏水50μl溶解激活剂F，水平摇动混匀；另取试剂盒中的蒸馏水100μl溶解AA，颠倒混匀。

12.分别在第二和第三通道的测试杯中，加入10μl激活剂F溶液；第三通道的测试杯中再加入10μl AA溶液。

15.对第一通道的测定结果进行TEG普通测定的第12~15步操作。

16.按“Muti”键，顺序点击第一通道、第二通道和第三通道测定图形，再按“Done”，将三个图形重叠，并计算出AA途径抑制率，并按TEG普通测定的第14步打印图形报告。

17.按TEG普通测定的第13步结束实验并将测试杯取出。

【性能参数】

将血小板抑制剂Reopro加入8份志愿者血中，按照NCCLS EP15-P文件要求，每份标本测定4次，MA值批内精密度为CV 9%，总精密度为CV 10%。

80.抗链球菌溶血素O（ASO）测定

【临床意义】

1.人体被A族溶血性链球菌感染后2周，患者血清中即可出现一定量的抗链球菌溶血素O抗体（ASO），约3~4周达到高峰，可持续较长时间。如血清ASO滴度不断上升，提示近期有化脓性链球菌感染，对急性扁桃体炎、急性肾小球肾炎、风湿热的诊断有重要意义。

2.类风湿性关节炎患者ASO不升高，可作为与风湿病的鉴别诊断。

3.患者确实有A族溶血性链球菌感染，但ASO持续阴性，可能是因发病早期用过大量的抗生素或免疫抑制药等。

【标本要求】

1.空腹采集静脉血3ml，建议使用血清样本，也可以使用肝素或EDTA抗凝血浆。

2.采集后两小时内离心分离血清或血浆。血清/血浆常温稳定8小时，2~8℃稳定72小时，超过72小时未测定应在-20℃冷冻保存。冷冻样本只能融化一次，如果重复冻融，样本中的分析物会发生变化。

【方法与原理】

1.方法速率散射比浊法。

2.原理结合在聚苯乙烯颗粒上的链球菌溶血素O抗原与待测标本中的抗链球菌溶血素O抗体形成抗原抗体复合物，悬浮在缓冲液中使散射光信号发生变化，通过测定信号增长的速率决定待测物浓度。

【仪器】

Beckman Coulter公司IMMAGE 800全自动特定蛋白分析仪。

【试剂】

1.试剂厂商 Beckman Coulter。

2.试剂盒结合在聚苯乙烯颗粒上的纯化重组的链球菌溶血素O抗原（7.5ml）。

3.试剂稳定性每天的工作完成后，将试剂盒放回到冰箱中（2~8℃）。使用防蒸发盖的情况下，ASO试剂可以在机上稳定30天。

4.缓冲液3和稀释液1 使用防蒸发盖，在系统上可以稳定30天。

5.校准品 Beckman Coulter公司校准品5 Plus（P/N469975），将校准品密闭保存在原装容器内，储存条件2~8℃，可以一直稳定到瓶上所示有效期。

6.质控品Beckman Coulter公司配套定值质控品，正常值和异常值两个水平。SERO CTL LEVl（450162）； SERO CTL LEV3（450164）.

【参数设置】

反应杯中样本和试剂的起始用量

样本量

总试剂量

抗原

缓冲液3

稀释液1

3.5μ1

333μl

23μl

292.5μl

17.5μl

【项目校准】

IMMAGE免疫化学系统的定标是批特异性的。试剂出厂时采用多点定标，用户操作时使用单点确认，进行截距的调整。

1.更换试剂批号或缓冲液3的批号后应校准。

2.更换特定部件时（如光源、比色杯）和保养程序后，试剂应重新定标。

3.质控失控后，在排除其他影响因素后，质控结果仍不满意的，应重新定标。

4.ASO定标稳定期为30天。

【性能参数】

1.分析范围使用起始血清样本稀释度1：6进行ASO浓度测定。

样本类型	BeckmanCoulter分析范围
血清	起始范围：25~800IU/ml 扩大范围：25~28800IU/ml

2.精密度 IMMAGE免疫化学系统评估的比较性能数据使用NCCLS建议的EP5-T2方案，结果见表1—4。

表1-4 ASO的精密度评估结果

精密度类型	样本	数据点	检测平均值（IU/ml）	SD（IU/ml）	%CV
血清水平1	80	84.5	1.71	2.0
批内	血清水平2	80	331.0	7.50	2.3
血清水平3	80	617.0	9.90	1.6
总	血清水平l	80	84.5	1.85	2.2
血清水平2	80	331.0	9.20	2.8
血清水平3	80	617.0	12.80	2.1