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【医技】检验科医疗诊疗规范——第二篇 临床基础检验51-59

作者:王泓 日期:2014-06-19

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    【临床意义】
    新生儿溶血三项是筛查母婴ABO血型不合造成的新生儿溶血病（ABO-HDN）的产后检测系统。ABO血型系统溶血病患儿的直接抗人球蛋白试验结果大部分是弱阳性或阴性；抗体释放试验阳性表明患儿红细胞被抗体致敏，是诊断ABO血型不合造成的新生儿溶血病敏感指标，直接抗人球蛋白试验与抗体释放试验有1项阳性即可诊断ABO-HDN；游离抗体试验有助于观察疾病的发展趋势和治疗，若有游离抗体，提示病情严重，游离抗体试验1项阳性只能作为参考而不能作为诊断依据。
    【标本要求】
    1.患儿血常规管静脉血标本3ml，如有凝块不影响检测。
    2.标本不可保存，立即检测。
    【仪器和材料】
    1.BioVue离心机和BioVue孵育器。
    2. 56℃水浴箱。
    【方法与原理】
    1.方法 抗原抗体凝集反应。
    2.原理 母婴ABO血型不合造成的新生儿溶血病（HDN），是由于胎儿受了父亲的遗传而获得的血型抗原恰为其母亲所缺少，则一定数量的胎儿的红细胞进入母体后便会刺激母体产生相应的IgG类血型抗体，此抗体再通过胎盘进入胎儿体内引起特异性抗原一抗体反应将胎儿的红细胞破坏。BioVue系统利用免疫学抗原和抗体的反应原理，采用微柱凝集技术进行抗体筛查检测。微柱由玻璃珠和柱中的试剂组成，玻璃珠的间隙起到了分子筛的作用。实验中，向抗人球蛋白（IgG）单特异检测试剂卡内分别加入患儿红细胞、释放液及血浆，通过离心，玻璃珠会阻挡住已经发生凝集反应的红细胞，而没有凝集的红细胞则可通过玻璃珠的缝隙到达微柱的底部，用以检查患儿体内红细胞是否已被IgG型抗体所致敏，及患儿血浆中有无游离IgG型抗体。
    （1）直接抗人球蛋白试验：利用被IgG型抗体致敏的红细胞能和抗人球蛋白抗体结合并发生凝集反应的原理，检测患儿体内红细胞是否已被IgG型抗体所致敏。
    （2）释放试验：IgG型抗体致敏的患儿红细胞可通过加热释放试验将抗体释放于释放液中，结合BioVue系统，用以检测患儿红细胞表面释放的不完全抗体。
    （3）游离抗体测定试验：结合BioVue系统，将已知A1、B、O抗原加入到患儿血清中，用以检测患儿血清中是否存在与其红细胞不配合的不完全抗体（IgG型抗A、B抗体）。
    【试剂】
    1.抗人球蛋白（IgG）单特异检测试剂卡。
    2.0.9%生理盐水。
    3.等渗生理盐水（BLISS液）。
    4.3%标准A1/B/O红细胞悬液。
    【操作步骤】
    1.首先核对患儿血型。
    2.取3个洁净试管分别标“释放液”、“血浆”、“直接”。
    3.患儿抗凝血3000转／分钟离心3分钟，吸出血浆备用（用于游离抗体试验）；将患儿离心后的抗凝血压积红细胞全部倒入一干净大玻璃管中并注明为压积红细胞管，如标本有凝块，请用滴管将其捣碎，将原始抗凝管的残留红细胞用生理盐水冲洗数次倒入压积红细胞管。压积红细胞管注满0.9%生理盐水，2000转／分钟离心2分钟，洗涤3次。洗涤过程中压积红细胞管的上清液用吸管吸掉，以免倒的过程中损失红细胞。最后一次吸上清液时保留上清液与压积’红细胞1：1即可。
    4.患儿3%红细胞悬液配制：取1个干净试管，加入500μl 0.9%生理盐水，再加入20μl压积红细胞管的压积红细胞，配成3%红细胞悬液用于直接抗人球蛋白实验。
    5.将压积红细胞管置56℃水浴中不断振荡7～8分钟，取出后立即2500转／分钟离心5分钟，酒石红透明的上清液即为释放液，将放散液移入干净试管。
    6.取出试剂卡，使用前确保试剂卡完全平衡到室温。撕开试剂卡上的锡纸，根据试验需要撕开所需孔（本试验需7孔）。撕开后的微柱请于1小时内进行后续操作。
    7.在试剂卡相应孔上标记好“释A”“释B”“释O”，“游A”“游B”“游O”，“直接”，向反应柱内分别加入50μl BLISS液。加样时枪头应与微柱管壁保持大约45°角，并避免直接接触。此目的是为了加样后，使微柱中的样本和试剂之间形成一定的空气间距。
    8.释放抗体操作步骤
    （1）抗人球蛋白卡“释A”“释B”“释O”孔中分别加入10μl 3%的标准A1/B/O红细胞悬液。
    （2）各孔均加入40μl放散液。
    9.游离抗体测定实验
    （1）抗人球蛋白卡“游A”“游B”“游O”孔中分别加入10μl 3%的标准A1／B/O红细胞悬液。
    （2）各孔均加入40μl患儿血浆。
    10.把加好样的“释A”“释B”“释O”，“游A”“游B”“游O”抗人球蛋白卡放入37℃的BioVue孵育器孵育10～30分钟。孵育后BioVue离心机离心5分钟，离心必须在加样后30分钟内进行。
    11.直接抗人球蛋白实验（直接Coombs）：抗人球蛋白卡“直接”孔内加入10μl 3%患儿红细胞悬液。加样后无需孵育，直接BioVue离心机离心5分钟，离心必须在加样后30分钟内进行。
    12.从微柱正反两面判读并记录结果。
    【判定标准】
    1.直接抗人球蛋白试验见图2-25；游离抗体试验和释放抗体试验见图2-26。

阳性结果（+）
红细胞凝集为阳性结果，表明患儿血浆中存在相应的IgG型抗体或患儿红细胞被IgG型抗体所致敏
阴性结果（-）
无溶血及红细胞未凝集是阴性结果，表明患儿血浆中不存在相应的IgG型抗体或患儿红细胞未被IgG型抗体所致敏

    图2-26 游离抗体试验和释放抗体试验（微柱法）
    溶血会导致玻璃珠上方呈浅粉色至红色。部分溶血时，有可能出现凝集
    2.结果解释
    （1）直接抗人球蛋白试验（DAT）
    阳性：红细胞被致敏。阴性：红细胞未被致敏。
    （2）游离抗体试验（IAT）
    阳性：血浆中有游离抗体。阴性：血浆中无游离抗体。
    判断游离抗体（抗A/B/O抗体）中哪种抗体阳性有临床意义需结合患儿血型。比如，患儿为A型，则抗B抗体阳性为正常，无临床意义。
    （3）释放抗体试验（IAT）（释A/B/O抗体中有一项阳性则释放抗体试验阳性）
    阳性：红细胞表面有抗体包被。阴性：红细胞表面无抗体包被。
    【参考范围】
    直接抗人球蛋白试验阴性（—），游离抗体试验阴性（—），释放抗体试验阴性（—）。
    【参考文献】
    1.金汉珍，樊绍曾.新生儿母婴血型不合溶血病.上海：上海科学技术出版社，1981：49-54，115-125
    2.叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006:266-268
    3. Hadley AG. Laboratory assays for predicting the severity of hemolytic disease of the fetus and new born. Transpl Immun01，2002，10（223）:191-198
    4. Hadley AG.A comparison of in vitro tests for predicting the severity of haemolytic disease of the fetus and newborn. Vox Sang，1998，74 Suppl 2:375-383
    5.张庆侠，郝建华，倪琳婷，等.三种方法检测孕妇血清IgG抗A（B）效价的结果比较，实用医技杂志，2008，2（15）：555-557
    【临床意义】
    T淋巴细胞及其亚群是重要的细胞免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等疾病中具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。HIV感染时，T4亚群数量显著减少（CD4+T细胞通常低于200个/μl），T4/T8比值明显降低，当T4亚群数量低于40个/μl时，预示病情凶险。监测HIV患者T4亚群有助于HIV/AIDS疾病的诊断和分期、判断疾病的进展、确定开始治疗的时机和判断治疗效果。CD4+T细胞计数的增加是HIV／AIDS治疗后判断疗效最重要的指标之一。
    此外，临床常用T4/T8比值来判断患者的细胞免疫状况。
    T4/T8比值升高：表示细胞免疫功能亢进，见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。
    T4/T8比值减低：表示免疫功能下降，见于艾滋病、病毒感染、肿瘤患者、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。
    肺泡灌洗液T细胞亚群的测定可以为结节病、特发性肺间质纤维化（IPF）、肺部恶性肿瘤等肺部疾病的鉴别诊断和疗效观察提供帮助。结节病：T细胞和T4细胞明显增多，T4/T8比值升高；特发性肺间质纤维化（IPF）：T8细胞显著增多，T4/T8比值明显降低；肺部肿瘤：T细胞数目无明显增多，但T4/T8比值下降；肺结核患者T细胞亚群在正常值范围之内。
    【标本要求】
    新鲜EDTA-K2抗凝的静脉全血2ml；肺泡灌洗液5～10ml；标本于室温下6小时内测定。
    【方法与原理】
    1.方法流式细胞术三色／四色直接免疫荧光法。
    2.原理根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，淋巴细胞可分成T细胞（CD3）、B细胞（CD19）和NK细胞（CD16+56）等；而T细胞又分为T诱导／辅助细胞（T4细胞，CD3+CD4+CD8-）和T抑制／杀伤细胞（T8细胞，CD3+CD8+CD4-）。将荧光素标记的单克隆抗体混合试剂CD3／CD4/CD8或CD45/CD3/CD4／CD8加入到全血中，单克隆抗体与淋巴细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤［和（或）固定］等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到T淋巴细胞及其亚群的相对百分数。
    【仪器】
    流式细胞仪EPICS XL（美国Beckman Coulter公司）。
    【试剂】
    1.单克隆抗体 Beckman Coulter公司的CD45-FITC／CD4-RD1／CD8-ECD/CD3-PC5，或CD4-FITC／CD8-PE/CD3-PC5.
    2.Beckman Coulter公司的OptiLyse C（溶血素）。
    3.CLENZ（Cleaning Agent，清洗液）。
    4.Isoton Ⅲ Diluent（稀释液或磷酸盐缓冲液或鞘液）。
    5.Flow-check荧光微球校准品。
    【操作步骤】
    1.标本荧光染色
    （1）全血标本前处理：取100μl抗凝全血或106个细胞／ml加入标号的12mm×75mm试管中，加入10μl荧光素标记的单克隆抗体混合试剂CD3/CD4／CD8或CD45／CD3／CD4／CD8，混匀，室温避光孵育20分钟；加入500μi溶血素，混匀，室温避光孵育10分钟；加入500μl稀释液，混匀，室温避光孵育10分钟；2小时内上机检测。
    （2）肺泡灌洗液前处理：取5～10ml肺泡灌洗液，用双层洁净纱布过滤于标号的15ml离心管中，500g离心5分钟，弃上清（残留沉淀物200μl左右）。混匀沉淀，取100μl加入标号的12mm×75mm试管中，加入10μl荧光素标记的单克隆抗体混合试剂CD3／CD4／CD8，混匀，室温避光孵育20分钟；加入300μl溶血素，混匀，室温避光孵育10分钟；加入300μl稀释液，混匀，室温避光孵育10分钟，500g离心5分钟，弃上清，加入500μl稀释液，混匀，2小时内上机检测。
    2.开机及仪器校准
    （1）启动之前，分别将鞘液盒和清洁液盒加满，废液桶倒净。
    （2）打开电源箱门，检查：AIR FILTER及VACUUM FILTER必须干燥无水，WATER TRAP液体不能超过1／3；VACUUM TRAP液体不超过1/4，然后打开电源箱开关。
    （3）开启计算机，双击相应的检测图标“EXPO32 ADC XL 4 Color”，启动流式细胞仪。
    预热15～20分钟，待仪器主机READY灯亮，即可开始上机检测。
    （4）仪器光路与流路校准：将Flow-check荧光微球校准品室温下避光放置10分钟，取5滴Flow Check放入洁净12mm×75mm的试管，加等量蒸馏水或鞘液，混匀，选择检测Flow Check的PROTOCOL，将稀释混匀的Flow Check试管放在样品台上进样检测，取数5000（FS），记录前向角散射光（FS）及荧光FL1～FL4的HPCV值，核对是否＜2%。仪器光路与流路校准合格后才能进行样本检测。
    3.标本上机检测
    （1）建立分析方案（Protocol）：选择相应的参数并画图，依次将同型对照管以及单阳性管（前处理同样本管）上机并调整合适的增益、电压和颜色补偿，保存该方案。方案建立好后，只要仪器状态及标本条件不变，即可一直使用该分析方案。
    （2）选择相应的分析方案（Protocol），将前处理好的标本管放在样品台上进样检测，调整门的大小。待仪器停止收集后，对结果进行分析和记录。
    4.清洗仪器 关机前需要执行仪器日常清洗程序和真空管清洗程序。
    5.关机。
    【判定标准】
    见图2-27。
    1.设门方法 CD45/侧向角散射光（SSC）。
    2.结果判定
    T细胞（T3）：CD3+。
    T诱导／辅助细胞（T4细胞）：CD3+CD4+CD8-。
    T抑制／杀伤细胞（T8细胞）：CD3+CD8+CD4-。
   
    图2-27 T淋巴细胞亚群（CD3/CD4/CD8）检测
    【参考范围】

项目
T细胞
T4细胞
T8细胞
T4/T8
参考范围（%）
61～85
28～58
19～48
0.9～2.0

    【参考文献】
    1.杜立颖，冯仁青.流式细胞术.北京：北京大学出版社，2008:83-92
    2.王兰兰，吴健民.临床免疫学与检验.北京：人民卫生出版社，2007: 200-201
    3. Centers for Disease Control and Prevention Guidelines for performing single-platform abso-lute CD4+ T-cell determinations with CD45 gating for persons infected with human immu-nodeficiency virus. MMWR，2003， 52（No.RR-02）:1-13
    【临床意义】
    B淋巴细胞是机体重要的免疫状态检测指标，主要用来评价体内体液免疫调节的平衡状态。
    【标本要求】
    新鲜EDTA-K2抗凝的静脉全血2ml，标本于室温下6小时内测定。
    【方法与原理】
    1.方法 流式细胞术单色直接免疫荧光法。
    2.原理根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，淋巴细胞可分成T细胞（CD3）、B细胞（CD19）和NK细胞（CD16+56）等。将荧光素标记的单克隆抗体CD19加入到全血中，CD19与B淋巴细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤［和（或）固定］等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到B淋巴细胞的相对百分数。
    【仪器】
    流式细胞仪EPICS XL（美国Beckman Coulter公司）。
    【试剂】
    1.单克隆抗体 Beckman Coulter公司的CD19-PE。
    2.Beckman Coulter公司的OptiLyse C（溶血素）。
    3.CLENZ（Cleaning Agent，清洗液）。
    4.Isoton Ⅲ Diluent（稀释液或磷酸盐缓冲液或鞘液）。
   5.Flow-check荧光微球校准品。
    【操作步骤】
    1.标本荧光染色 取100μl抗凝全血或106个细胞／Hll加入标号的12mm×75mm试管中，加入10μl荧光素标记的CD19，室温避光孵育20分钟；加入500μl溶血素，室温避光孵育10分钟；加入500μl稀释液，室温避光孵育10分钟；2小时内上机检测。
    2.开机及仪器校准
    （1）启动之前，分别将鞘液盒和清洁液盒加满，废液桶倒净。
    （2）打开电源箱门，检查：AIR FILTER及VACUUM FILTER必须干燥无水，WATER TRAP液体不能超过1／3；VACUUM TRAP液体不超过1/4，然后打开电源箱开关。
    （3）开启计算机，双击相应的检测图标“EXP032 ADC XL 4 Color”，启动流式细胞仪。
    预热15～20分钟，待仪器主机READY灯亮，即可开始上机检测。
    （4）仪器光路与流路校准：将Flow-check荧光微球校准品室温下避光放置10分钟，取5滴Flow Check放入洁净12mm×75mm的试管，加等量蒸馏水或鞘液，混匀，选择检测Flow Check的PROTOCOL，将稀释混匀的Flow Check试管放在样品台上进样检测，取数5000 （FS），记录FS及荧光FL1～FL4的HPCV值，核对是否＜2%。仪器光路与流路校准合格后才能进行样本检测。
    3.标本上机检测
    （1）建立分析方案（Protocol）：选择相应的参数并画图，依次将同型对照管以及单阳性管（前处理同样本管）上机并调整合适的增益、电压和颜色补偿，保存该方案。方案建立好后，只要仪器状态及标本条件不变，即可一直使用该分析方案。
    （2）选择相应的分析方案（Protocol），将前处理好的标本管放在样品台上进样检测，调整门的大小。待仪器停止收集后，对结果进行分析和记录。
    4.清洗仪器关机前需要执行仪器日常清洗程序和真空管清洗程序。
    5.关机。
    【判定标准】
    见图2-28。
   
    图2-28 B淋巴细胞检测
    B细胞（CD19）和NK细胞（CD16+56）等；
    【参考范围】
    B淋巴细胞（CD19）计数：5.0%～20%。
    【参考文献】
    1.杜立颖，冯仁青.流式细胞术.北京：北京大学出版社，2008:83-92
    2.王兰兰，吴健民.临床免疫学与检验.北京：人民卫生出版社，2007:200-221
    3. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for performing single-platform abso-lute CD4+ T-cell determinations with CD45 gating for persons infected with human immu-nodeficiency virus. MMWR，2003， 52（No. RR-02）:1-13
    【临床意义】
    NK细胞具有抗肿瘤和抗感染等作用，可以直接杀伤各种肿瘤细胞和感染某些病毒和细菌的细胞。NK细胞计数减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂、疲劳综合征患者等。NK细胞计数随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应。在白介素-2治疗后，外周血NK细胞计数增加。
    【标本要求】
    新鲜EDTA-K2抗凝的静脉全血2ml，标本于室温下6小时内测定。
    【方法与原理】
    1.方法流式细胞术双色直接免疫荧光法。
    2.原理根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，淋巴细胞可分成T细胞（CD3）、B细胞（CD19）和NK细胞（CD16+56）等。将荧光素标记的单克隆抗体CD16+56加入到全血中，CD16+56与NK细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤［和（或）固定］等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到NK细胞的相对百分数。
    【仪器】
    流式细胞仪EPICS XL（美国Beckman Coulter公司）。
    【试剂】
    1.单克隆抗体 Beckman Coulter公司的CD3-FITC/CD（CD16+56）-PE。
    2.Beckman Coulter公司的OptiLyse C（溶血素）。
    3.CLENZ（Cleaning Agent，清洗液）。
    4.Isoton Ⅲ Diluent（稀释液或磷酸盐缓冲液或鞘液）。
    5.Flow-check荧光微球校准品。
    【操作步骤】
    1.标本荧光染色 取100μl抗凝全血或106个细胞／ml加入标记好号的12mm×75mm试管中，加入10μl荧光素标记的CD16+56，室温避光孵育20分钟；加入500μl溶血素，室温避光孵育10分钟；加入500μl稀释液，室温避光孵育10分钟；2小时内上机检测。
    2.开机及仪器校准
    （1）启动之前，分别将鞘液盒和清洁液盒加满，废液桶倒净。
    （2）打开电源箱门，检查：AIR FILTER及VACUUM FILTER必须干燥无水，WATER TRAP液体不能超过1/3；VACUUM TRAP液体不超过1／4，然后打开电源箱开关。
    （3）开启计算机，双击相应的检测图标“EXPO32 ADC XL 4 Color”，启动流式细胞仪。
    预热15～20分钟，待仪器主机READY灯亮，即可开始上机检测。
    （4）仪器光路与流路校准：将Flow-check荧光微球校准品室温下避光放置10分钟，取5滴Flow Check放入洁净12mm×75mm的试管，加等量蒸馏水或鞘液，混匀，选择检测Flow Check的PROTOCOL，将稀释混匀的Flow Check试管放在样品台上进样检测，取数5000（FS），记录FS及荧光FL1～FL4的HPCV值，核对是否＜2%。仪器光路与流路校准合格后才能进行样本检测。
    3.标本上机检测
    （1）建立分析方案（Protocol）：选择相应的参数并画图，依次将同型对照管以及单阳性管（前处理同样本管）上机并调整合适的增益、电压和颜色补偿，保存该方案。方案建立好后，只要仪器状态及标本条件不变，即可一直使用该分析方案。
    （2）选择相应的分析方案（Protocol），将前处理好的标本管放在样品台上进样检测，调整门的大小。待仪器停止收集后，对结果进行分析和记录。
    4.清洗仪器 关机前需要执行仪器日常清洗程序和真空管清洗程序。
    5.关机。
    【判定标准】
    见图2-29。
    【参考范围】
    NK细胞（CD16+56）计数：8.0%～26%。
   
    图2-29 NK淋巴细胞检测   【参考文献】
    1.杜立颖，冯仁青.流式细胞术.北京：北京大学出版社，2008:83-92
    2.王兰兰，吴健民.临床免疫学与检验.北京：人民卫生出版社，2007:200-201
    3. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for perfornung single-platform abso-lute CD4+ T-cell determinations with CD45 gating for persons infected with human immu-nodeficiency virus. MMWR， 2003，52（No. RR-02）:1-13
    【临床意义】
    非小细胞肺癌患者在使用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（易瑞沙、特洛凯）前，应进行EGFR第21号外显子点突变的检测，L858R突变阳性提示患者对该药物的具有潜在敏感性，而基因野生型患者提示药物的疗效欠佳。
    【标本要求】
    1.EDTA-K2抗凝静脉全血5ml。避免抽血时的第一管血、溶血及脂血标本。
    2.立即检测或4℃保存少于4小时。
    【方法与原理】
    1.方法 基因组DNA经PCR扩增后进行片段大小分析。
    2.原理 EGFR基因第21号外显子存在第858号亮氨酸变为精氨酸的替代突变（即第2573号碱基T突变为G）。利用特异性引物扩增包含此片段的DNA序列，野生型基因扩增产物包含Msc Ⅰ酶切位点，而突变型基因扩增产物中由于碱基的替代Msc Ⅰ酶切位点消失，生成Sau96 Ⅰ酶切位点，利用Msc Ⅰ切割扩增产物，特异地去除野生型基因以富集突变型基因，再次进行PCR扩增后，利用Sau96 Ⅰ对突变型片段进行特异切割，产物经变性高效液相色谱仪进行片段大小分析，片段为130bp大片段为野生型，出现99bp小片段说明存在突变型基因。
    【仪器和材料】
    Thermo Cell恒温金属浴箱（HB-202），Heraeus离心机（Mμltifuge 4KR）， Thermo Scientific台式离心机（Legend Micro 17），Bio-Rad PCR扩增仪（My Cycler），Transgenomic变性高效液相分析仪（WAVE 4500），Eppendorf 1ml、200μl、100μl、10μl移液枪，Axygen 1.5ml、200μl EP管，Axygen 1ml、200μl、100μl、10μl Tip头。
    【试剂】
    1.试剂血浆核酸提取试剂盒QIAamp Blood DNA Mini Kit：蛋白酶K分装后-20℃冷冻保存，其余试剂室温保存。无菌无酶双蒸水：2～8℃保存使用。无水乙醇：室温保存使用。GoTaq Colorless PCR master mix：未拆封时于-20℃冷冻保存，开盖后于2～8℃保存使用，实验时置于4℃冰盒中使用。内切酶Msc Ⅰ：-20℃冷冻保存，使用时置于2～8℃。引物E21-1F、E21-R、E21-2F，-20℃冷冻保存，使用时置于2～8℃。
    2.质控品 突变型质控品为细胞系H1975和A549基因组DNA混合物，野生型质控品为细胞系A549基因组DNA。
    【操作步骤】
    1.试剂配制
    （1）使用无菌无酶H2O将引物粉末溶解成浓度为100μmol／L，作为储存引物溶液保存于-20℃备用。使用无菌无酶H2O将储存引物溶液稀释10倍，终浓度为10μmol／L，为使用溶液，保存于-20℃备用。
    （2）按照血浆核酸提取试剂盒说明书，向各洗脱液中加入无水乙醇。
    2.血浆中游离核酸提取
    （1）将5ml静脉血以3000转／分钟的速度离心10分钟，取400μl血浆至1.5ml EP管中。
    （2）向EP管中加入40μl蛋白酶K，颠倒混匀后，加入400μl溶液AL，颠倒混匀，于恒温干浴箱中56℃孵育10分钟。
    （3）轻轻离心EP管使管壁液体留下。
    （4）向EP管中加入400μl无水乙醇，颠倒混匀15秒，轻轻离心使管壁液体流下。
    （5）取600μl液体，加入QIAamp Mini Spin Column中，台式离心机中6000×g离心1分钟，将QIAamp Mini Spin Column置于新的收集管中，将EP管中剩余溶液加入QIAamp Mini Spin Column重复离心，再次将QIAamp Mini Spin Col-umn置于新的收集管。
    （6）向QIAamp Mini Spin Column中加入500μl洗脱液AW1，6000×g离心1分钟，将QIAamp Mini Spin Column置于新的收集管中，弃去装有液体的收集管。
    （7）向QIAamp Mini Spin Column中加入500μl洗脱液AW2，13300×g离心3分钟。
    （8）将QIAamp Mini Spin Column置于新的收集管中，弃去装有液体的收集管，于13300×g再次离心1分钟。
    （9）将QIAamp Mini Spin Column置于无菌无酶的1.5ml EP管后向柱内加入60μl AE（预先温浴至55℃），室温静置30分钟，6000×g离心2分钟。所得标本保存于-20℃。
    3.基因组DNA的PCR扩增和突变型基因富集 质控品与标本进行平行测定，结果为H1975-GFR基因第21号外显子出现点突变，A549 EGFR第21号外显子为野生型，则当次质控结果合格。
    （1）取200μl PCR反应管，按如下体系进行第一轮PCR扩增

H2O
2×GoTaq Master Mix
E21-1F
E21-R
DNA
5.5μl
12. 5μl
1. 0μl
1. 0μl
5. 0μl

    （2）取新的PCR反应管，按如下体系于37℃进行酶切反应

H2O
10×Buffer
Mscl
一轮PCR产物
14. 0μl
2. 0μl
2. 0μl
2. 0μl

    （3）取新的PCR反应管，按如下体系进行第二轮PCR扩增

H2O
2 X GoTaq Master Mix
E21-2F
E21-R
DNA
9. 5μl
12. 5μl
1. 0ul
1.0μl
1.0 μl

    （4）取新的PCR反应管，按如下体系于37℃进行第二轮酶切反应

H2O
10×Buffer
Sau961
二轮PCR产物
4. 0μl
2. 0μi
2. 0μl
12. 0μl

    （5）将扩增产物置于变性高效液相分析仪中，采用非变性片段分析模式进行分析。
    【判定标准】
    阴性结果：洗脱峰为单个尖锐峰，位置同野生标本洗脱峰，说明基因为野生型，L858R突变阴性；
    阳性结果：洗脱峰为单个尖锐峰，位置同突变样本洗脱峰，说明基因为突变型，L858R突变阳性；洗脱峰为2个尖锐峰，位置分别对应突变及野生标本的洗脱峰，说明基因为野生型和突变型混杂，L858R突变阳性（图2-30）。
   
    图2-30 EGFR第21号外显子点突变检测结果
    1. NCCN clinical practice guidelines in oncology（non-small cell lung cancer）version 1. 2011
    2.Asano H，Toyooka S，Tokumo M，et aL Detection of EGFR gene mutation in lung cancer by mutant-enriched polymerase chain reaction assay. Clin Cancer Res，2006，12（1） :43-48
    3.Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med， 2004，350（21） :2129-2139
    4. Bai H，Mao L，Wang HS，et al. Epidermal growth factor receptor mutations in plasma DNA samples predict tumor response in Chinese patients with stages IIIB to IV non-small-cell lung cancer.J Clin Onc01，2009 ， 27（16） : 2653-2659
    5. Kimura H，Sununoe M，Kasahara K，et al. Evaluation of epidermal growth factor receptor mutation status in serum DNA as a predictor of response to gefitinib（IRESSA）. Br J Cancer，2007，97（6）:778-784
    【临床意义】
    非小细胞肺癌患者在使用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（易瑞沙、特洛凯）前，应进行EGFR第19号外显子DEL746 -750缺失突变的检测，突变阳性提示患者对该药物具有潜在敏感性，而基因野生型患者提示药物的疗效欠佳。
    【标本要求】
    1.EDTA-K2抗凝静脉全血5ml。避免抽血时的第一管血、溶血及脂血标本。
    2.立即检测或4℃保存少于4小时。
    【方法与原理】
    1.方法 基因组DNA经PCR扩增后进行片段大小分析。
    2.原理 EGFR基因第19号外显子存在746至750号氨基酸共5个氨基酸（即2236至2250碱基共15bp）的缺失突变。利用特异性引物扩增包含此片段的DNA序列，野生型基因扩增产物包含Mse Ⅰ酶切位点，突变型基因扩增产物由于碱基的缺失不包含此酶切位点，利用Mse Ⅰ切割扩增产物，特异地去除野生型基因以富集突变型基因，再次进行PCR扩增，利用变性高效液相色谱技术对扩增产物进行片段大小分析，片段为138bp为野生型基因，出现123bp的小片段说明存在突变型基因。
    【仪器和材料】
    Thermo Cell恒温金属浴箱（HB-202），Heraeus离心机（Multifuge 4KR），Thermo Scientific台式离心机（Legend Micr0 17），Bio-Rad PCR扩增仪（My Cycler），Transgenomic变性高效液相分析仪（WAVE 4500），Eppendorf 1ml、200μl、100μl、10μl移液枪，Axygen 1.5ml、200μl EP管，Axygen 1ml、200μl、100μl、10μl Tip头。
    【试剂】
    1.试剂 血浆核酸提取试剂盒QIAamp Blood DNA Mini Kit:蛋白酶K分装后-20℃冷冻保存，其余试剂室温保存。无菌无酶双蒸水：2～8℃保存使用。无水乙醇：室温保存使用。
    GoTaq Colorless PCR Master Mix:未拆封时于-20℃冷冻保存，开盖后于2～8℃保存，使用时置于4℃冰盒。限制性内切酶Mse Ⅰ：-20℃冷冻保存，使用时置于4℃冰盒。引物E19-1F、E9-1R、E19-2R:主要成分为寡核苷酸序列，-20℃冷冻保存，使用时置于4℃冰盒。
    2.质控品 突变型质控品为细胞系H16 50和A549基因组DNA混合物，野生型质控品为细胞系A549基因组DNA。
    【操作步骤】
    1.试剂配制
    （1）使用无菌无酶H2O将引物粉末溶解成浓度为100μmol／L，作为储存溶液保存于-20℃备用。使用无菌无酶H2O将储存引物溶液稀释10倍，终浓度为10μmol／L，为使用溶液，保存于-20℃备用。
    （2）按照血浆核酸提取试剂盒说明书，向各洗脱液中加入无水乙醇。
    2.血浆中游离核酸提取
    （1）将5ml静脉血以3000转／分钟的速度离心10分钟，取400μl血浆至1.5ml EP管中。
    （2）向EP管中加入40μl蛋白酶K，颠倒混匀后，加入400μl溶液AL，颠倒混匀，于恒温干浴箱中56℃孵育10分钟。
    （3）轻轻离心EP管使管壁液体留下。
    （4）向EP管中加入400μl无水乙醇，颠倒混匀1.5秒，轻轻离心使管壁液体流下。
    （5）取600μl液体，加入QIAamp Mini Spin Column中，以6000×g离心1分钟。将QIAamp Mini Spin Column置于新的收集管中，将EP管中剩余溶液加入QIAamp Mini Spin Column重复离心，再次将QIAamp Mini Spin Column置于新的收集管。
    （6）向QIAamp Mini Spin Column中加入500μl洗脱液AW1，6000×g离心1分钟，将QIAamp Mini Spin Column置于新的收集管中，弃去装有液体的收集管。
    （7）向QIAamp Mini Spin Column中加入500μl洗脱液AW2，13300×g离心3分钟。
    （8）将QIAamp Mini Spin Column置于新的收集管中，弃去装有液体的收集管，于13300×g再次离心1分钟。
    （9）将QIAamp Mini Spin Column置于无菌无酶的1.5ml EP管后向柱内加入60μl AE（预先温浴至55℃），室温静置30分钟，6000×g离心2分钟。所得标本保存于-20℃。
    3.基因组DNA的PCR扩增和突变型基因富集
    质控品与标本进行平行测定，结果显示突变型质控品EGFR基因第19号外显子出现15bp缺失突变，A549 EGFR第19号外显子为野生型，则当次质控结果合格。
    （1）取200μl PCR反应管，按如下体系进行第一轮PCR扩增

H2O
2×GoTaq Master Mix
E19-1F
E19-1R
DNA
5.5μl
12.5μl
1.0μl
1.0μl
5.0μl

    （2）取新的PCR反应管，按如下体系于37℃进行酶切反应

H2O
10×Buffer
BSA
Msel
一轮PCR产物
14. 8μl
2.0μl
0. 2μl
1. 0μl
2. 0z l

    （3）取新的PCR反应管，按如下体系进行第二轮PCR扩增

H2O
2×GoTaq Master Mix
E19-1F
E19-2R
DNA
9. 5μl
12. 5μl
1. 0μl
1. 0μl
1. 0μl

    （4）将扩增产物置于变性高效液相分析仪中，采用非变性片段分析模式进行分析。
    【判定标准】
    阴性：洗脱峰为单个尖锐峰，位置同野生型标本洗脱峰，说明基因为野生型，DEL746-750突变阴性。
    阳性：洗脱峰为3个尖锐峰，位置同突变标本洗脱峰，说明基因为野生型和突变型混杂，DEL746-750突变阳性；洗脱峰为单个尖锐峰，位置同突变标本的突变峰（第2个峰），说明基因为突变型，DEL746- 750突变阳性（图2-31）。
   
    图2-31 EGFR第19号外显子缺尖突变检测结果
    【参考范围】
    EGFR基因19号外显子无缺失突变，为野生型。
    【参考文献】
    1. NCCN clinical practice guidelines in oncology（non-small cell lung cancer）version 1.2011
    2. Asano H，Toyooka S，Tokumo M，et al.Detection of EGFR gene mutation in lung cancer by mutant-enriched polymerase chain reaction assay. Clin Cancer Res，2006，12（1）:43-48
    3. Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al.Activating Mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.N Engl J Med， 2004，350（21）:2129-2139
    4. Bai H，Mao L，Wang HS，et al.Epidermal growth factor receptor mutations in plasma dna samples predict tumor response in chinese patients with stages IIIB to IV non-small-cell lung cancer.J Clin Onco1，2009，27（16）:2653-2659
    5. Kimura H，Suminoe M，Kasahara K，et al.Evaluation of epidermal growth factor receptor mutation status in serum DNA as a predictor of response to gefitinib（IRESSA）. Br J Cancer，2007，17；97（6）:778-784
    【临床意义】
    1.ABO血型鉴定临床意义
    （1）临床输血：当循环血量不足、大失血或贫血需要进行输血治疗时，输血前必须选择血型相同的供者，再进行交叉配血，完全相合后才能输血。O型母亲孕育A型或B型胎儿时，妊娠期若需输血，必须坚持同血型输血。如遇紧急情况，必须用异型血时，AB血型患者可接受其他血型血液，但以B型血为优先考虑，并且尽量少用。A型血有许多亚型，容易造成输血反应，因此尽量不要输给异型血患者。
    （2）器官移植时受者与供者也必须ABO血型相符合才能移植，血型不符极易引起急性排异反应导致移植失败。
    （3）母婴ABO血型不合引起的新生儿溶血病，主要是依靠血型血清学检查来诊断。
    （4）亲子鉴定：法医上可用于否定亲子关系。
    2.Rh血型鉴定临床意义
    （1） Rh血型系统一般不存在天然抗体，故第一次输血时，不会发生Rh血型不合。但Rh阴性的受血者接受了Rh阳性血液后，可产生免疫性抗Rh抗体，如再次输受Rh阳性血液时，即可发生溶血性输血反应。
    （2）Rh阴性母亲孕育胎儿为Rh阳性时，胎儿的红细胞经胎盘进入母体，刺激母体产生抗Rh抗体，再经胎盘进入胎儿体内，由于第一胎产生的抗Rh抗体很少，极少发生新生儿溶血病。到第二次怀孕Rh阳性胎儿，所产生抗Rh抗体增多，可致新生儿溶血病。若Rh阴性孕妇有曾输过Rh阳性血液史，或第一胎因Rh血型不合有流产史，那么第一胎也可发生胎儿溶血病。Rh阴性妇女曾孕育过Rh阳性的胎儿，当受输Rh阳性血液时，也会出现溶血反应。
    【标本要求】
    EDTA-K2抗凝全血或10%红细胞生理盐水悬液。
    【方法与原理】
    1.方法凝集试验（纸板法、玻片法及试管法）。
    2.原理根据红细胞表面有无A抗原和（或）B抗原，可将血型分为A型、B型、AB型及O型4种。ABO血型系统的抗体为IgM型，血型抗原与相应抗体在反应介质中可形成红细胞和相应血型抗体结合的免疫复合物，出现肉眼可见凝集，据此可进行ABO血型鉴定。ABO血型鉴定正定型采用直接凝集试验即红细胞表面抗原与定型抗体的凝集反应。ABO血型鉴定反定型是用已知的A抗原红细胞和B抗原红细胞来测定血清中有无相应的抗A和（或）抗B。Rh-D血型是由红细胞表面存在或缺失D抗原确定，被检红细胞与抗D血清凝集者为Rh-D阳性，不凝集者为阴性。
    【仪器和器材】
    血型鉴定专用纸板、吸管、摇床、离心机、显微镜。
    【试剂】
    1.正定型
    （1） ABO血型鉴定试剂：抗A、抗B血型定型试剂（单克隆抗体），主要成分为：分泌抗人A型和抗人B型血型抗原单抗的杂交瘤细胞培养上清液体，效价≥1: 128。保存条件：2～8℃，避光保存。
    （2）Rh-D血型鉴定试剂：试剂主要成分：细胞株BS226细胞培养上清液，为IgM类单克隆抗体。未开封试剂2～8℃可稳定至效期，开盖后试剂室温稳定3～4天。放置室温时一定要拧紧盖子。
    2.反定型 人ABO反定型用红细胞试剂盒。
    【操作步骤】
    1.每日质控 取前一天已发报告的血型分别为AB型和O型的标本各一份，Rh-D阳性和保留的Rh-D阴性血标本各一份，分别再次测定，结果与前一天已发报告相符，则当天质控结果合格。
    2.取血型定型纸板1张，顺序编号。
    3.每个标本做3孔（从左至右依次为1、2、3孔），第1孔和第2孔做ABO血型鉴定，第3孔做Rh-D检测。在第1孔和第2孔中分别滴加抗A、抗B试剂各一滴，在第3孔中滴加Rh-D试剂1滴，再分别在3个孔中滴加受检者全血或10%红细胞生理盐水悬液1滴，混匀并水平轻摇至出现凝集（红细胞亚型抗原性弱，如抗A、抗B标准血清效价低时，易造成漏检或误定，加做抗A、抗B血清和反向定型，可避免漏检）。
    4.室温放置5分钟以上，观察凝集情况，判定结果。
    5.ABO血型鉴定反定型将样本以3000转／分钟，离心3分钟，获得受检者血清。在纸板上按顺序编号，用吸管分别加入1滴受检者血清于纸板相应位置，随后加入A、B及O试剂红细胞1滴。应先加受检者血清再加试剂红细胞，避免漏加受检血清。在摇床混匀2分钟，将纸板轻轻摇动，观察有无凝集。
    6.结果判定
    （1） ABO血型鉴定结果判定

正定型
反定型
（标准血清+被检者红细胞）
（标准红细胞+被检者血清）
结果判断
抗A
抗B
抗AB
A型红细胞
B型红细胞
O型红细胞
+
-
+
-
+
-
A型
-
+
+
+
-
-
B型
+
+
+
-
-
-
AB型
-
-
-
+
+
-
O型

    （2） Rh-D血型检测结果判定：轻摇玻片或纸卡，观察凝集结果，出现凝集为阳性，未出现凝集为阴性。判断结果应在2～5分钟内，避免因标本干枯而引起假阳性。
    7.血型鉴定如出现弱凝集反应，按以下步骤操作：
    （1）取受检者少量红细胞放入一洁净大试管，加入生理盐水混匀，1500转／分钟离心2分钟，如此洗涤红细胞2～3次，用以去除非特异性抗原成分。
    （2）去掉上清液，将洗涤后红细胞配成5%红细胞盐水悬液，用试管法鉴定：取洁净小试管2支，分别标明抗A、抗B、Rh-D试剂分别加入相应定型血清1滴，再各加入受检者5%红细胞盐水悬液1滴，混合。立即以1000转／分钟离心1分钟。将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以肉眼观察有无凝集，如凝集很弱，应将反应物倒于玻片上以低倍镜观察。
    （3）凝集强度判断标准
    4+ 红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。
    3+ 红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。
    2+ 红细胞凝块分散成许多小块，见到游离红细胞。
    1+ 肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞。
    ± 镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞。
    MF 混合凝集外观（Mixed Field），镜下可见少量红细胞凝集，绝大多数红细胞呈均匀分布。
    - 镜下未见凝集，红细胞均匀分布。
    （4）“3+”以上直接按凝集回报；“1+～2+”必须在报告单上注明弱凝集，建议做反定型或亚型鉴定；“±”和“混合凝集外观”建议抽血复查。
    8.新生儿由于红细胞ABO血型抗原较弱，应直接用玻片法定型，放置时间应延长，弱凝集按以上方法操作。
    9.对含有较多冷凝集素的受检者，需用37℃生理盐水洗涤受检者红细胞2～3次，以去除吸附在红细胞上的冷凝集素，然后再鉴定血型。
    10.如发现ABO正反定型结果不一致，首先应排除实验室工作人员操作错误，随后排除来自红细胞和血清样本方面的相关问题。
    （1）严格执行操作规程，重复正反定型试验。
    （2）若结果仍不一致重新抽取受检者新鲜血液标本，纠正因污染、搞错样本或样本溶血造成的不符合。
    （3）如试验结果红细胞呈缗钱状排列，加入等渗盐水1滴混合，往往可使缗钱状消失。
    （4）延长样本孵育时间、排除冷凝集干扰。
    （5）询问查询患者年龄、输血史、移植史、用药史等情况综合判断。
    （6）若正反定型结果仍不相合，可将样本送至血库鉴定，以观察是否存在类B抗原，红细胞已被致敏，不规则抗体，A、B抗原性减弱等情况。
    11.用过的定型纸板晾干后直接作为原始记录保存，保存至少1年备查。原始标本在2～8℃保存15天。
    【临床意义】
    同手工法。
    【标本要求】
    EDTA-K2抗凝静脉血。
    【方法与原理】
    1.方法微柱凝胶法。
    2.原理 Johnson-Johnson orTHO AutoVue Innova全自动血型分析仪血型鉴定采用柱凝集技术（column agglutination technique，CAT），血型鉴定卡的微柱内装有玻璃珠和试剂，将红细胞定量加入微柱使其与柱内的抗血清反应，离心，玻璃珠之间的间隔为7～8μm，仅容许单个红细胞通过，因此特异性凝集的红细胞不能通过玻璃珠“屏障”，全部浮于玻璃珠上端而被视为“阳性反应”，未凝集的红细胞则顺利通过玻璃珠到V字底部被视为“阴性反应”。
    戴安娜自动配血系统同样采用凝胶卡式技术来检测红细胞的凝集反应。当试剂或血清或血浆标本中红细胞的抗原与相应的抗体结合时就会发生凝集。DG凝胶卡是一块含有8个微孔管的塑料板，每个微孔管由一个柱子和一个分配／孵育室组成。每个胶柱的缓冲介质都含有具有微孔筛作用的右旋糖酐微球聚体，右旋糖酐与含有特殊抗体或含有缓冲液的试剂混合。微孔管的胶溶液含有的特殊抗体作为反应介质，红细胞可与其发生凝集反应。离心过滤过程取决于细胞大小，凝聚红细胞被截留在胶柱的表面或周边。游离红细胞下沉至微孔管的底部。
    【仪器】
    Johnson-Johnson orTHO AutoVue Innova全自动血型分析仪或戴安娜自动配血系统。
    【试剂】
    1.Johnson-Johnson orTHO AutoVue Innova全自动血型分析仪
    （1）Ortho BioVue ABO/Rh 血型鉴定：Ortho BioVue ABO/Rh血型鉴定卡由6个微柱组成，每一柱含有缓冲液，其成分为牛血清蛋白、大分子增强剂以及0.1%叠氮钠和0.01mol／L的乙二胺四乙酸（EDTA）。其中1号柱与4号柱相同，含有抗A血型鉴定试剂；2号柱与5号柱相同，含有抗B血型鉴定试剂；3号柱与6号柱相同，含有抗D血型鉴定试剂。
    （2）0.1mol／L NaOH溶液，生理盐水，蒸馏水。
    2.戴安娜自动配血系统
    （1）DG Confirm凝胶卡：每个微孔管的缓冲介质中都含有右旋糖酐聚体，防腐剂及混合的不同试剂。不同的微孔管通过卡前面的标签来识别。微孔管A：单克隆抗A（鼠源性单克隆IgM抗体16243 G2和16247 E6的混合物）；微孔管B：单克隆抗B（鼠源性单克隆IgM抗体9621 A8）；微孔管D:单克隆抗D（人类源性单克隆IgG和IgM抗体即P3x290，P3x35，P3x61和P3x21223 Bl0的混合物），这些卡中的单克隆抗D试剂可检测不完全D抗原的部分异体，包括DVI异体；微孔管Ctl:不含抗体的缓冲液（质控孔）试剂备用。
    （2）低离子液：与红细胞混合制成5%红细胞悬液；洗液A:酸性，与洗液B中和；洗液B：碱性，冲洗探针和混匀池。
    【操作步骤】
    Johnson-Johnson orTHO AutoVue Innova全自动血型分析仪
    1.开机
    （1）开机前检查生理盐水桶、蒸馏水桶液体体积是否足够，废液桶是否清空。
    （2）打开设备电源，打开PC电源，启动AutoVue Innova软件。以“常规（Routine）”模式登录，等待初始化程序完成后点击“继续（Continue）”按钮。
    2.装载试剂
    （1）点击“主舱门（Main Cover）”，打开主舱门，在稀释平板左侧装载浅反应孔稀释板，在不搅拌试剂区（NAA）3号位置放入0.1mol／L NaOH溶液，手动关闭主舱门。已部分使用过的稀释板须在已使用过的每列第一孔加满生理盐水。
    （2）点击“抽屉（Drawer）”，拉出抽屉，按需求补充试剂卡，条码向左。装载试剂卡前，确认试剂卡在有效使用期内，锡箔纸完好无损且无气泡、干柱等现象。关闭抽屉后系统自动检查试剂卡状态，并在“状态（Status）”屏幕的“抽屉（Draw-er）”选项上显示最新状态。试剂卡抽屉最多可装载12个试剂卡套架，每个试剂卡套架最多可容纳20个试剂卡。
    3.样本操作
    （1）样本前处理：样本首先3000转／分钟离心3分钟，以获得压积红细胞。
    （2）注册样本：点击“样本舱门（Access Cover）”，打开样本舱门，点击“样本（Sample）”，点击“注册／装载”进入样本注册界面。选择屏幕上方的“注册”和“指定位置”复选框，设置实验组套参数。输入样本参数，选择样本类型，输入样本标识号回车后再次输入样本标识号。指定样本在样本架上的位置，此时样本架上为该样本指定“U”（使用中）状态。点击“添加至列表（Add to list）”，该批所有样本注册完成后，点击“发送至工作列表（Send to Worklist）”，将样本添加到工作列表。
    （3）装载样本：将样本放置于样本架指定位置，样本架装载于指定样本转子上。可通过屏幕样本架信息或设备中的转位按钮将样本架旋转至适当的装载位置。注意：每个样本架上只可放置9个样本。关闭样本舱门，系统初始化样本转子以检查所有样本，“样本架”屏幕将显示样本状态，初始化通过后启动加样。若出现错误需及时纠正。样本运行过程中需关闭所有4个设备门。
    （4）执行质控步骤，填写相关记录。
    （5）若需要保存试剂卡，该样本注册后选择屏幕上“选项”中“保存试剂卡”复选框。
    4.结果查看
    （1）点击“结果（Results）”，选择“工作列表”可查看已请求，正在进行中，已结束但结果未接收或被拒绝的实验。选择“已完成工作列表（Completed）”可查看已完成实验结果，触摸某一实验结果可显示实验详情对话框。若实验结果判断有误，进入实验详情界面拒绝实验结果；若实验没有完成，可点击样本号取消实验组，查找原因后重新测定。
    （2）搜索历史结果。点击“搜索（Search）”，点击“New Search”，选择工作列表和时间区间，定义搜索条件，点击执行。
    5.数据备份将DVD光盘格式化，正确命名。每日备份以星期一至星期日分别命名，每周备份以年份命名。
    6.关机卸载仪器中试剂卡与样本，取出稀释板和0.1mol／L NaOH溶液，清空垃圾桶中试剂卡。关闭AutoVue Innova软件和Windows，系统会自动用蒸馏水冲洗探针。关闭显示器电源，关闭设备电源。
    戴安娜自动配血系统
    1.开机打开设备电源（机身后方右下角），当机身前方左下角指示灯亮，打开PC电源、打印机。双击操作系统图标进入操作系统并完成初始化，此时Diana C.和Diana R.将同时启动。双击页面Diana O.图标，届时屏幕共出现三个对话框（Diana C.Diana R.Diana O.）开机完成。
    2.试剂装载
    （1）从冰箱中取出低离子液和凝胶卡，复温10～15分钟。
    （2）将低离子液放置在试剂盘R9位置上条码向外。
    （3）确认凝胶卡在有效使用期内，锡箔纸完好无损且无气泡、干柱等现象，依次将其放入卡槽中，条码向左，卡槽最多可放置24个凝胶卡。
    （4）凝胶卡后方有两个卡槽，左侧的卡槽需装入一张凝胶卡用于离心时配平。
    （5）凝胶卡槽下方自左向右依次为：废液瓶、洗液A瓶、洗液B瓶、废弃卡托盘。其中洗液A瓶和洗液B瓶内液体均由洗液A、B的原液一瓶与2L去离子水混合配制。
    3.质控品的测定 在每日开机测试标本前应进行阴性和阳性的质控品测定。若质控结果不合格，必须从仪器、试剂和材料等方面查找原因。
    4.样本操作
    （1）样本前处理：检查样本是否够量（至少2ml）、是否有凝块。3000转／分钟离心3分钟，以获得压积红细胞。
    （2）样本上机
    1）点击开门图标，舱门自动打开，从1号位开始放置样本，将标本放置完成后，关闭仓门。
    2）点击黑色箭头，出现对话框提示请清空废卡盒，单击确定。
    3）在Test处选择“血型确认”，点击Identify键（如有条形码，则自动识别样本号和试管直径；如没有，则只识别试管直径），机器将自动检测从1号位置开始的所有样本，然后单击Samples（样品栏），样品盘在放置样本的相应位置（从1号开始）出现问号，依次单击问号出现对话框，输入样本编号，回车后，再次输入样本编号。
    4）将全部显示问号的位置输入相应编号后点击对话框下方小黑人图标，所有上机标本位置变红，此时点击下方向右的黑色箭头开始实验。
    5.结果查看
    （1）点击Diana O.中第二个图标出现Results by sample对话框点击Seletbatchs to list选择当前实验批次后回车，再点击OK，当前样本将以列表形式显示结果，点击上方保存键（Save to file）即可传送结果。
    （2）点击Diana R.中“眼睛”图标选择当前实验批次后点击OK，即可出现凝胶卡上的凝集结果，左上角选择相应凝胶卡Barcode即可看到相应标本在此卡上的凝集状态（一张卡为两个样本）。
    （3）既往结果查询：点击Diana O.中最右侧工具栏选择Traceability List-ing，选择日期点击OK，出现查询当天所有结果，选择要查询的批次点击OK即可看到结果。
    6.数据处理
    （1）数据转移：点击Diana O.中最右侧工具栏选择Batch Cancellation，出现对话框点击ALL／none全部选中，点击OK出现确认对话框，点击“是”即可。被选中数据会从“Diana R.”软件中转移到数据恢复文件夹。
    （2）数据恢复：点击“Diana O”软件中的小扳手，选择Batch Decancellation（批次恢复），选择需要被恢复的批次，被选中数据会自动恢复到“Diana R”软件中，注意：在批次恢复中只存储试验完成72小时之内的数据，超过72小时的数据将被软件自动转存至指定的历史数据文件夹。
    （3）数据查询：针对保存超过72小时的数据，点击“Diana O”软件中的小扳手，选择Traceability Listing（历史数据查询），选择需要查询的日期，显示当日做的所有批次，根据批次查找所需结果，结果显示为打印版。
    7.关机在Diana C.最右侧黑色1，点右键选择Final Wash冲洗机器，然后依次关闭三个对话框（Diana C.Diana R.Diana O.）、PC、打印机、设备电源。
    【结果判定】
    以Johnson-Johnson orTHO AutoVue Innova全自动血型分析仪为例。
    1.BioVue Ⓡ试剂卡（图2-32）
    2.结果判定（图2-33～图2-35）
   
    图2-32 （1）BioVue Ⓡ试剂卡正面    （2）BioVueⓇ试剂卡反面
   
    图2-33 结果从左至右为A型
    RhD阳性，B型RhD阳性
   
    图2-34 结果从左至右为AB型
    RhD阳性，O型RhD阳性
   
    图2-35 结果从左至右为B型RhD阳性.AB型RhD阴性
    【临床意义】
    1.低切变率全血黏度
    （1）结果增高：表示全血黏度增高，血液流动性差，红细胞聚集性增加，影响器官与组织细胞的血液灌注，如冠心病与心肌梗死等。
    （2）结果降低：多由于低HCT造成，是血液稀释造成，如贫血、肿瘤等。
    2.高切变率全血黏度
    （1）高切变率黏度正常：表示红细胞的变形性和取向正常，血液在高切变率下的黏度适当。
    （2）黏度增高：表示红细胞的变形性下降，导致红细胞在血流中的流动取向发生异常变化，从而增加了高切变率的全血黏度，即影响血液的携氧和释放功能。同时也会引起其他血液有形成分的异常改变，如因异常的血流使血小板受损，激活血小板，增加血栓形成的机会；如因红细胞硬化取向改变，使正常的血液中心轴流性改变，白细胞由血流中心被挤到血流的边缘，增加与血管壁接触，从而导致白细胞的流变性改变，阻塞血流，使微循环发生障碍。
    3.血浆黏度 主要取决于血浆蛋白的数量和特性，尤其是血浆纤维蛋白原浓度的影响。
    （1）血浆黏度增高：表明血浆蛋白浓度增加，尤其是纤维蛋白原增高或血脂增高。可直接影响血氧的传输速度，使组织细胞的新陈代谢受影响，导致组织缺氧、微循环障碍、红细胞变形性下降、继而引起缺血，代谢产物堆积，最终引起全血黏度增高和一系列的血液流变性改变。
    （2）血浆黏度过低：多由于血浆蛋白的含量降低，如肾病、肿瘤。
    4.全血还原黏度 HCT作为主要的因素，对全血黏度有决定性的影响。为了消除HCT对血液黏度的影响，引入了全血还原黏度的概念。
    （1）压积正常，全血黏度正常，还原黏度增高，提示红细胞聚集性增强，实际血黏度增高。
    （2）压积偏高，血黏度偏离，还原黏度正常，提示实际黏度正常。
    5.ESR方程K值 利用方程式来表达ESR与HCT的关系，以获得更符合实际的ESR。根据ESR和ESR方程K值的对应关系来分析ESR、HCT和红细胞聚集性三者的关系。
    （1） ESR正常，K值正常，表明ESR与红细胞聚集均正常。
    （2） ESR正常，K值增大，表明HCT增加，较高的HCT使ESR表面上处于正常范围，但实际上ESR增加，红细胞聚集性也高。
    （3） ESR增加，K值正常，表明HCT降低，较低的HCT使ESR表面上加快，实际上ESR与红细胞聚集性均正常。
    （4） ESR增高，K值增大，表明ESR增快，红细胞聚集性增高。
    6.红细胞聚集指数 红细胞表面带有负电荷，在流动的血液中，细胞间具有相互排斥的力，防止红细胞聚集。当血液在静止状态下，红细胞在血浆中即发生聚集，相互形成网络，构成红细胞聚集体。这种红细胞网络具有一定的强度，当推动血液流动的切应力大于此强度时，血液在开始流动时，这种红细胞聚集的状态解除，红细胞的这种特殊性称为红细胞聚集性。一般红细胞聚集指数换算：全血黏度值（低切变率）／全血黏度值（高切变率）。红细胞聚集性增高见于糖尿病、高血压、心肌梗死、外周血管疾病、动脉或静脉血栓形成等。
    7.红细胞变形指数红细胞膜是一种双分子生物膜，它使正常的红细胞具有良好的变形性，当红细胞通过比它自身直径要小得多的毛细管时，可以很容易地发生变形，顺利地通过微血管。红细胞在切应力作用下改变的能力称为红细胞的变形性。红细胞变形指数可表示红细胞变形能力，红细胞变形性异常主要见于溶血性贫血、心肌梗死、冠心病、高血压、脑血栓、糖尿病和恶性肿瘤等。
    8.细胞电泳指数 红细胞电泳指数=红细胞聚集指数/HCT。红细胞电泳指数降低见于缺血性脑卒中、出血性卒中、冠心病、心肌梗死及系统性红斑狼疮等。
    【标本要求】
    1.EDTA-K2抗凝静脉血5ml。
    2.枸橼酸钠抗凝血，3. 8%枸橼酸钠0.4ml与静脉血1.6ml充分混合均匀。
    【方法与原理】
    1.方法锥板式旋转黏度计法。
    2.原理通过一个低惯性的转矩马达对被测试流体施加一个受控应力，驱动轴由一个低阻力磁浮轴承保持在中心位置，它将施加的应力传递到被测流体上，其测试头为锥板式。整个测试过程由计算机控制自动进行。切变率可在（1～200） S-1之间任意设置，并可实时描记切变率与黏度二维曲线。其测定原理是依据牛顿黏性定理，即理想流体在层流条件下遵循下列关系：τ=η×γ
    γ—切变率：S-1
    η—流体的黏度系数：Pa·S
    τ—切应力：Pa 如果流体的黏度系数η不随切变率及相应的切变力变化，即维持一个常数，则该流体为牛顿流体。与此相反，如果液体的黏度与切变率有关，即在不同切变率下黏度为不同数值，则该液体为非牛顿流体。血液的黏度表现为低切变率下黏度相当高，随切变率的上升黏度逐渐降低；当切变率高到一定程度（例如200 S-1之上）之后，黏度逐渐达到一个较低的稳定值。
    【仪器】
    SA-6000血流变分析仪、自动全血细胞分析仪、自动血沉测定仪。
    【试剂】
    0.9%生理盐水、清洗液。
    厂家提供质控品于2～8℃冰箱保存。
    【操作步骤】
    1.开机 检查废液桶是否清空，0.9%生理盐水及清洗液（蒸馏水：清洗液=100：1）是否充足。打开SA-6000机身后面开关，点击面板上“电源”使灯由红变绿。打开电脑主机并进入SA-6000血流变程序，点击任务栏中的“维护”，仪器自动执行。
    2.质控品测定将质控品恢复室温并充分混合（切勿产生气泡），吸取约4ml置于小试管中放入仪器第一孔位中。点击任务栏中“设置”一非牛顿质控（孔位选择1-1，质控黏度范围与质控品上一致）一增加测试（测试值若在质控黏度范围内则可进行标本测试）→保存→关闭→维护（任务栏中）。每日测定全血黏度低切变率1及全血黏度低切变率200两个点位，观察确认测定数值均在控制范围内，可进行标本测定。如失控，停机查找原因直到失控纠正后再测定标本。
    3.分别进行全血细胞分析（EDTA-K3抗凝静脉血）和动态红细胞沉降率测定（3. 8%枸橼酸钠抗凝静脉血）。
    4.将检测完毕的全血细胞分析标本按照对应的编号放入血流变分析仪相应孔位槽内，在电脑屏幕测试状态下右键点击1号位选择“批量输入”，根据标本数量设置孔位号数目，标本类型选择“全血”。点击“确定”，全血测定开始。
    5.测定结束后，将标本离心：3500转／分钟，离心15分钟。
    6.观察离心后的血浆量是否达到1ml以上：
    （1）若血浆量＜1ml则执行手动操作：“任务栏”中设置→手动测试→用加样器吸取0. 8ml血浆，沿切血池慢慢注入加样孔→选择测试项目为“血浆”。点击“确定”，血浆测定开始。
    （2）量≥1ml的标本按顺序放回测定全血的相应孔位中，在电脑屏幕测试状态下右键点击1号位选择“批量输入”，根据测定全血的数量设置孔位号数目，标本类型选择“血浆”。点击“确定”，血浆测定开始。
    7.测试结束后查看所有标本的血浆黏度值，若＞2则有可能吸到血细胞，需重新离心操作。
    8.测试结束后将电脑左图中的白线拖至100/s处则显示测试结果→点击保存→点击清洗。
    9.数据录入及传输在任务栏中点击“录入”按标本编号顺序将各个标本的血细胞比容和血沉结果输入相应位置。点击任务栏中“搜索”→立即查询。将屏幕最左侧所有序号都选中（Ctrl+A），单击右键选择“上传数据”。若执行单个结果传输，则点击需传输的标本序号，右键点击“上传数据”。
    10.仪器既往结果查询 点击任务栏中“搜索”→选择左侧的“前天”→选择需查找的日期→立即查询，所查询标本将显示。
    11.关机 点击任务栏中“维护”，当维护结束后：关闭电脑→主机面板上电源→机身后电源。清空废液桶，贮备足够的清洗液和0.9%生理盐水。
    【参考范围】
    血液黏度的参考范围随黏度计类型、测定方法、实验条件和地区的差异不尽相同，此参考范围为本实验室根据测定不同人群等因素为本仪器建立的参考范围。

项目
女
男
全血黏度低切变率1（1/s）mPa·s
全血黏度低切变率5    （1／s）mPa·s
全血黏度中切变率30 （1/s） mPa·s
全血黏度高切变率200   （1／s）mPa·s
全血还原黏度低切变率
全血还原黏度中切变率
全血还原黏度高切变率
血浆黏度mPa·s
红细胞聚集指数
红细胞变形指数
红细胞刚性指数
红细胞电泳指数
血沉方程K值
13.24～18. 31
6. 62～8. 53
3. 90～5.18
3. 32～4. 09
23. 08～48. 89
5. 42～11. 34
3. 06～8. 26
1. 20～1. 70
3.24～5. 67
0. 45～1. 11
1. 80～6. 88
6. 47～16. 20
0～103. 55
17. 01～ 20.61
8. 05～9. 58
3. 96～6. 52
3. 45～4. 58
30. 80～55. 46
6. 90～11. 97
3. 68～9. 66
1. 20～1. 61
3. 71～ 5. 97
0. 53～1. 19
2. 29～8. 05
7. 43～17. 07
0～77. 66

    【参考文献】
    1.谭齐贤.临床血液学和血液检验.第3版.北京：人民卫生出版社，2006:308-310
    2.彭黎明，邓承祺.现代血栓与止血的实验室检测及其应用.北京：人民卫生出版社，2004: 277-284
    3.许文荣，王建中.临床血液学和血液检验.第4版.北京：人民卫生出版社，2007:400-404


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