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医技

【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇临床微生物检验1-10

作者:王泓日期:2014-06-19

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第三篇临床微生物检验

1.革兰染色

【临床意义】

1.根据革兰染色的结果和菌体形态特点，可提供临床医师早期治疗的依据。

2.在无菌标本中涂片染色检出菌体，无论是革兰染色阳性菌或革兰染色阴性菌，都应提示有临床意义，应电话通知临床主管大夫。

3.在标本中检出形态疑似诺卡菌形态的菌体，电话通知临床主管大夫。建议进行诺卡菌培养和弱抗酸染色。

4.革兰染色检出有隔菌丝，应建议做真菌培养，并电话通知临床主管大夫。

5.痰标本革兰染色根据白细胞与上皮细胞的比例评价痰标本的质量，评估痰标本中检出的菌体的临床价值。

【标本要求】

1.临床标本通常包括：毛刷、支气管吸取物、鼻拭子、痰、支气管肺泡灌洗液（BALF）、分泌物、体液（血液、脑脊液、胸水、腹水和关节液等）、伤口脓液和组织等。此外还包括液体肉汤和固体培养皿培养的菌体。

2.痰液患者清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿留取唾液，送检。

3.无菌体液无菌容器送检，标本量＞2ml。

4.不可接受的标本咽拭子，干的拭子、蜡盒、未消毒容器、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。

【原理】

细菌被染成蓝紫色或红色主要根据其细胞壁的组成和结构。革兰阳性菌具有厚的肽聚糖层和大量的磷壁酸，不受酒精脱色的影响仍保留最初的蓝紫色，革兰阴性菌具有单一的肽聚糖层，其上结合有一种不均一的脂多糖——磷脂双分子层外膜。外膜可以被酒精脱色，使得结晶紫——碘复合物外泄，最终复染为红色。

【仪器】

普通光学显微镜。

【试剂】

1.结晶紫（厂家：Biomerieux 货号：55545）。

2.碘液（厂家：Biomerieux 货号：55546）。

3. 95%乙醇（厂家：Biomerieux 货号：55547）。

4.石碳酸复红（厂家：Biomerieux 货号：55548）。

【操作步骤】

1.操作步骤

（1）用铅笔在玻片的毛玻璃处写上患者的化验号。

（2）在生物安全柜中用无菌棉签蘸取患者的标本均匀涂在玻片上。

（3）涂好标本的玻片在生物安全柜中用紫外灯照30分钟。

（4）将制备好的涂片在酒精灯的火焰上固定。

（5）结晶紫染色30秒，流水冲洗。

（6）碘液复染30秒，流水冲洗。

（7）95%酒精脱色10～15秒，流水冲洗。

（8）石碳酸复红复染1分钟，流水冲洗。自然风干。（无菌体液涂片不要用不洁净的滤纸擦拭玻片上残留的水滴。）

（9）光学显微镜检查（物镜100×，目镜10×）普通光源下观察。菌体呈现蓝紫色为革兰染色阳性，菌体呈现红色为革兰染色阴性。

2.结果报告

（1）如果涂片中没有看到细菌，报告未找到细菌。

（2）革兰阳性球菌报告如：革兰阳性球菌成对，成链，成堆排列。呈矛头相对，有荚膜，可疑肺炎双球菌；是否位于中性粒细胞内。

（3）革兰阳性杆菌报告如：粗大杆菌，两端平齐；分支样的杆菌；棒状样杆菌；并注明有无荚膜，或是否被中性粒细胞吞噬。成团丝状菌，染色不典型，可疑诺卡菌。

（4）革兰阴性菌报告如：双球菌，肾性成对；杆菌，粗胖，可疑肠杆菌细菌；杆菌，可疑非发酵糖菌；球杆菌，可疑不动杆菌；长丝状杆菌，具有多形性的革兰阴性杆菌。并注明有无荚膜，或是否被中性粒细胞吞噬。如果荚膜异常宽厚，报告可疑黏液型绿脓杆菌；革兰阴性菌小杆菌，成堆，可疑嗜血杆菌。

（5）真菌报告如：找到酵母样孢子及假菌丝。

伤口和脓肿涂片革兰染色可提供临床医师初步的信息，根据提示的信息可尝试开始早期的抗生素治疗，实验室技术人员可根据涂片提示的信息选择特殊的培养基及特殊的培养条件。

痰标本低倍镜下评价痰标本质量的方法见表3-1。在涂片中如有柱状上皮细胞不应记数于鳞状上皮细胞中，应注明其数量，作为合格标本对待。

表3-1 痰标本显微镜检查的分类

细胞数／低倍镜
WBC	鳞状上皮细胞
6 5 4 3 2 1	＜25 ＞25 ＞25 ＞25 10～25 ＜10	＞25 ＜10 10～25 ＞25 ＞25 ＞25

注：分类中1～3类不做培养，要求重新留取标本；4、5类为合格标本；6类为气管穿刺液时，如未见WBC，而鳞状上皮细胞＞10/LP，也应重新留取标本

2.血培养

【临床意义】

血培养阳性对患者的诊断和预后有重要的意义。血培养阳性的原因：当细菌或真菌在血液中迅速繁殖，超出网状内皮系统清除能力，而且引流或抗感染治疗失败，就会产生持续菌血症，并感染血管外组织，也可能病原微生物经淋巴管进入血流；或患者发生血管内感染，例如：感染性心内膜炎，真菌性动脉瘤，化脓性静脉炎，感染性动脉瘘和动静脉导管炎。

对入院的重症患者，采血培养应该在系统性抗生素治疗之前，患者发热（≥38℃）或低温（≤36℃），白细胞增多（计数大于10×10⁹／L，特别是出现核左移未成熟的或杆状核），粒细胞减少（成熟的多核白细胞小于1×10⁹/L）或上述几种情况并存时进行。

在评估可疑新生儿败血症中，除发热或低烧外，很少培养出细菌，常要加补做尿和脑脊液的培养。小儿，特别是2岁或2岁以下幼儿，患肺炎球菌与流感嗜血杆菌菌血症，伴明显发热（≥39.4℃）和白细胞增多（总数≥10×10⁹／L）。

老年患者菌血症，可能不发热，低热，尤其伴有不适，肌痛或卒中可能是感染心内膜炎的信号。

【标本要求】

血液、脑脊髓液、关节液、胸腹腔积液等无菌部位的标本。每个血培养瓶注入无菌抽取的规定量的静脉血。为防止皮肤寄生菌污染培养瓶，采集静脉血前要用消毒剂（碘酊或碘仿）对皮肤进行仔细充分的消毒处理，以便将污染减少到最低程度。标本采集后立刻送到实验室，在不得已的情况下，可短期内（≤12小时）置于室温，不要冷藏。采集血培养瓶数量和采血时间：

1.可疑急性原发性菌血症或真菌血症，脑膜炎，骨髓炎，关节炎或肺炎，依据临床情况立即取血作2～3份血培养。

2.不明原因的发热（例如：深部脓肿，伤寒热，波浪热）首次取血作2～3份血培养，24～36小时后，估计温度快要升高之前，立即再取血作2～3份血培养（通常在下午）。

3.可疑感染性心内膜炎，在头1～2小时内，取血作3份血培养，如果24小时后3份结果均阴性，再取血作3份血培养。

4.入院前2周内接受抗生素治疗的患者，3天内连续取血作血培养，每天2份。

【方法与原理】

血培养是把静脉穿刺获得的血液接种到一个或多个培养瓶中，用来发现、识别细菌或其他可培养分离的微生物。

3D血培养仪：检测系统采用光电比色的原理，连续定量监测血培养瓶中微生物产生的CO₂量。检测系统由传感器、比色计探头组成。对CO₂敏感的传感器镶嵌在每个血培养瓶的底部，瓶底的渗透隔膜将细菌产生的CO₂与肉汤隔开，CO₂能扩散穿过隔膜，与传感器中的指示剂反应，产生颜色变化，由蓝变墨绿，乃至黄色。比色计探头位于培养箱内每个瓶孔底座处，内含发射光二极管和吸收光二极管，它们将瓶底颜色转换成电压信号，信号强弱与传感器中的颜色变化成比例。

BACTEC 9120基本原理：微生物生长过程中的代谢产物CO₂将激活瓶内底部荧光感应物质而发出荧光，荧光信号变化与CO₂变化成正比。仪器瓶位内的探测器探测到该荧光信号的变化并经一组运算公式的运算，得出荧光信号变化的各种参数，从而判断培养瓶内是否有微生物生长。每10分钟探头对培养瓶扫描监测一次，连续监测系统自动地查出微生物的生长，并发出多种信号通知操作人员。菌血症是临床医学急症，引起菌血症的细菌通常是多重耐药菌，尽早采集血培养和进行准确的抗生素敏感试验对危重患者感染的诊断，治疗和预后有重要的临床意义。

【仪器】

法国梅理埃公司BacT/AlerT 3D全自动监测系统。

美国BD公司BACTEC9120血培养仪。

【试剂】

该仪器使用的培养基种类与成分见表3-2，有效期内可室温贮藏。

表3-2 血培养仪常用的培养基的种类与成分

培养瓶种类	代号	成分特点	空气	肉汤量（ml）	接种血量（ml）
需氧特殊瓶厌氧特殊瓶儿童瓶	FA FN PF	吸附抗生素用活生炭吸附抗生素用活性炭脑心浸液汤	含不含含	30（3D）/25（9120） 40（3D）/25（9120） 20（3D）/40（9120）	3～10（8～10最适） 3～10（8～10最适） 0.5～3

【操作步骤】

1.血培养瓶接收标准

（1）检查培养瓶确保安全地放置。

（2）用肉眼观察微生物生长的可视信号，注意血液层上面是否有絮状沉淀、均匀的或表面下的混浊、溶血、液体培养基凝固、有一层表面薄膜、产生气体、血层表面或深层有白色颗粒等。

（3）检查瓶子上的标签，与申请单上的患者资料是否一致。

（4）瓶内血液量必须够量，也不能超量。

2.不合格血培养标本的处理

（1）拒收培养瓶：血培养瓶标识与化验申请单不符，培养瓶破裂或明显污染。处理方法：立即与临床医师联系，报告拒收的具体理由。

（2）补做培养瓶：血标本采集后放置12小时以上，用不适当类型的培养瓶收集标本，用过期的培养瓶收集标本，采血量不足等。处理方法：立即与临床医师联系，报告标本不合格的具体理由，建议补做血培养。

3.血培养操作采集标本后的血培养瓶立即上机监测，孵育温度设为35～36℃。在LIS系统中扫描条形码，录入患者的姓名，年龄，性别，病历号，专科，采集时间，上机时间，标本类型及血瓶条码。

仪器报警及红灯闪烁的血培养瓶可能为阳性瓶。立即用注射器无菌法抽取阳性瓶中培养物做涂片、革兰染色、显微镜检查。同时接种中国兰平皿、血琼脂平皿，必要时增加厌氧血平皿或巧克力琼脂平皿。依据显微镜检查结果，一方面向临床报告细菌形态及染色特性。另一方面可做初步的、非标准抗生素敏感试验。

戴乳胶手套，在生物安全柜或防止传染的超净台内操作。

（1）BacT/AlerT 3D血培养仪操作

1）加载培养瓶

①核实血培养瓶标识与化验申请单相符，培养瓶完好无损，无明显污染，采血量足够。

②在主屏按下加载培养瓶按钮，有空单元的抽屉的照明指示灯亮。

③扫描培养瓶ID。

④缓慢拉开照明指示灯亮的抽屉，把培养瓶插入有照明灯亮的单元。

⑤单元指示灯缓慢闪烁，确认培养瓶已加载。

⑥对每个剩下的培养瓶，重复③～⑤步骤。可以把培养瓶加载到同一抽屉中，直到装满所有可用单元。装满后，轻轻关闭这个抽屉，打开有照明指示器的另一个抽屉。

⑦载了所有培养瓶以后，确保所有抽屉都被彻底关闭。

⑧在LIS系统中键入加载培养瓶的患者数据（患者的姓名，年龄，性别，病历号，专科，采集时间，上机时间，标本类型及培养瓶数据）。

2）卸载培养瓶

①在主屏上按下卸载按钮。

②打开指示灯亮的抽屉，除去单元指示灯亮指示的一个培养瓶，单元灯缓慢闪烁，确认已经除去了培养瓶。卸载阳性瓶需要扫描培养瓶ID。卸载阴性瓶不需要扫描培养瓶ID。

③重复②步骤，卸载掉所有指示的培养瓶。

④当卸载培养瓶完成之后，确保所有抽屉都被彻底关闭。

（2）Bactec 9120血培养仪操作

1）信息输入：培养瓶准备完毕后

①撕下培养瓶上的双条码之一，贴于送检报告，以备查询。

②在LIS系统中键入加载培养瓶的患者数据（患者的姓名，年龄，性别，病历号，专科，采集时间，上机时间，标本类型及培养瓶数据）。

2）培养瓶状态的颜色显示

瓶位状态	软件界面		主机孵育架	其他显示
瓶位状态	瓶位编号	Summary	相应瓶位指示灯
可利用瓶位	灰色	灰色	N/A	N/A
正在培养的培养瓶（Ongoing）	绿色	绿色	N/A	N/A
阴性瓶（Negative）	绿色	绿色	绿色	N/A

续表

瓶位状态	软件界面		主机孵育架	其他显示
瓶位状态	瓶位编号	Summary	相应瓶位指示灯
阳性瓶（Positive）	红、绿双色	红、绿双色	红、绿双色	主机外部阳性瓶指示灯亮
匿名瓶（Anonymous）	黄色	黄色	黄色	N/A
错误瓶／瓶位（Error Station）	红色	红色	红色	主机外部系统错误指示灯亮
等待重新放回瓶位	灰色，闪烁状态	灰色	N/A	N/A
指定的等待放入瓶位	绿色	灰色	红、绿双色	N/A
封闭瓶位	黑色	黑色	N/A	N/A

3）培养瓶的上机与取出

①上机（Vial Entry）：培养瓶信息输入电脑后

a.打开主机门。

b.用条码扫描仪扫条码面板“Vial Entry”。

c.扫描瓶上条码，孵育架上瓶位指示灯亮。

d.将培养瓶放入指定瓶位。

e·听到“嘀嘀嘀”三声指示操作结束，关门。

注意：请勿在检测时（软件界面孵育架显示L或T）开门，否则将丢失一次检测数据。

②取出阴性瓶（Remove Negative）：主机对普通细菌培养的默认培养周期为5天，5天内如检测不到细菌生长，将作为阴性瓶处理，软件界面“Summary”与瓶位编号指示阴性瓶出现。

a.打开主机门。

b.用条码扫描仪扫描条码面板“Remove Negative”，阴性瓶所在位置瓶位指示灯亮。

c.逐个取出阴性瓶。仪器设定为“成批取出阴性瓶”，无需再扫描瓶上条码。核对取出阴性瓶的数量与电脑上显示的数量是否相符，确认无误后关门。

③取出阳性瓶（Remove Positive）：主机检测到阳性瓶后，软件界面“Summary”，瓶位编号以及主机外部“Positive Vial”均会给出阳性指示，并伴有报警声。

a.按F2消除报警声。

b.打开主机门。

c.扫描条码面板“Remove Positive”，阳性瓶所在位置瓶位指示灯亮。

d.逐个取出阳性瓶，并同时扫描瓶上条码。

e.听到“嘀嘀嘀”三声指示操作结束，关门。

4）重新放回功能：对于阳性瓶，如在仪器设置中设置了重新放回功能“Re-Entry”，则仪器保留该瓶位以及相关数据3小时，等待重新输入，重新输入时操作同培养瓶上机操作。

注意：如果3小时内不将该培养瓶重新放回，则所有数据不再保留。

5）报警与错误处理

①错误种类

错误类型			可能的产生原因
Anonymous		匿名瓶／孤儿瓶	培养瓶未插入指定位置／培养瓶上机时未扫描瓶上条码
Error Station	VialMissing	培养瓶丢失	取出培养瓶时未扫条码或培养瓶错插入其他位置而造成空位
BadStation	瓶位损坏	瓶位检测器损坏

Ⅰ.匿名瓶与孤儿瓶（Identify Anonymous）：当培养瓶未插入指定瓶位或培养瓶上机时未扫描瓶上条码，仪器无法找到相关培养瓶资料，因而报错，错误类型为匿名瓶与孤儿瓶，软件界面“Summary”和瓶位编码均显示有“Anonymous”出现。

a.打开主机门。

b.扫描条码面板“Identify Anonymous”，孵育架上匿名瓶瓶位指示灯亮。

c.从指定位置取出匿名瓶，扫描瓶上条码，仪器指示应放入位置，孵育架上指定位置指示灯亮。

d.将培养瓶放入指定位置。

e.如指定位置为原位置，则听到“嘀嘀嘀”三声指示操作结束，关门。 f.如指定位置为其他位置，同时计算机指示该培养瓶已在系统中存有资料，则执行下列步骤。

g.在计算机上按“ESC”退回上级菜单。

h.扫描条码面板“Identify Anonymous”。

i.扫描任一备用条码。

j.扫描条码面板任一培养瓶种类条码，孵育架上原匿名瓶位改变为指定瓶位等待重新放入。

k.扫描条码面板“Resolve Error”。

Ⅰ.扫描条码面板“Vial Return”。

m.听到“嘀嘀嘀”三声，关门，此时该瓶位软件界面指示变为“Ongoing”。

n.在计算机上对新瓶位（原匿名瓶瓶位）执行人工瓶位状态阴性设定。

Ⅱ.错误瓶位与错误瓶（Resolve Error）：当“Ongoing”的瓶位中培养瓶丢失或检测器发生故障时，系统报告Error Station，软件界面“Summary”，瓶位编号，以及主机处部指示灯“System Error”均会有出错指示，并伴有报警声。

a.按F2消除报警声。

b.打开主机门。

c.扫描条码面板“Resolve Error”孵育架上错误瓶位指示灯亮。

d.确定培养瓶是否在指定瓶位并完全插好。

a）养瓶未完全插好，或未在指定瓶位但可以立刻找回：将培养瓶放回指定瓶位并确保插好，扫描条码面板“Vial Return”听到“嘀嘀嘀”三声指示操作结束，关门。

b）培养瓶未在指定瓶位，且不能找回：扫描条码面板“Vial Missing”在计算机上对该瓶位执行人工瓶位状态阴性设定。

c）培养瓶已在指定位置，并完全插好：扫描条码面板“Bad Station”，封闭该瓶位。

注意：

当系统同时存在匿名瓶和错误瓶时，请务必先解决匿名瓶。

②培养瓶状态的人工设定（Manual NegativelPositive）：如果由于解决错误的需要，正在培养过程中的培养瓶状态可以进行人工设定。

a.计算机按F3 Culture。

b.在“Station”下输入需人工设定状态的培养瓶位置。

c.将光标移动到“Status”，当前显示状态为“Ongoing”。

d.按F9，在计算机对话框提示下输入“N”（阴性）或“P”（阳性）。

e.按F10确认。

f.再按F10存盘。

h.如果设定为阴性瓶，则执行取出阴性瓶程序（Remove Negative）。

g.如果设定为阳性瓶，则执行取出阳性瓶程序（Remove Positive）。

注意：如果人工设定为阳性瓶，同时仪器设有重新放回功能（Re-Entry），则该瓶位将被保留3小时，并在保存数据中有阳性瓶记录。

6）其他软件功能

①培养瓶状态与资料查询（F3 Culture）：Ongoing的培养瓶可以在计算机上直接查询培养瓶状态与相关文字资料。

a.按F3。

b.将光标移到“Sequence”。

c.扫描送检报告上贴有的培养瓶条码。

d.或在“Accession”下扫入（输入）实验室条码。

e.屏幕显示所有文字状态与资料。

②生长曲线查询（F4 Plot Utility）：Ongoing或已经结束培养的培养瓶可以在计算机上直接查询生长曲线。

a.按F4 Plot Utility。

b.在Plot Station下输入欲查询的培养瓶位置。

c.在Plot Starting Date下输入该培养瓶放入主机的日期。如果该培养瓶还在主机内，则无需输入该日期。日期输入格式为DD/MM/YYYY。

d.按F10，生长曲线形成。

e.按ESC，退出提示屏。

f.按F4，查看曲线。

注意：目前使用的计算机可以保存1000个曲线，一般标本量时每个标本可以保存曲线约14天。

③工具菜单（F5 Utility）：

功能描述

F3	Configuration	系统设置
F5	Backup	数据备份
F7	Restore	备份回顾
F9	Activities	手工方式

a.系统设置（F3）：以下所有功能均建议由BD工程师或产品专员设定。

项目	功能
Hospital	输入医院名称，输入的名称将会出现在主屏幕顶部（Title）
Instrument Communica-tion Port	主机与系统计算机通讯接口编号，默认值为1
Instrument # Racks	登录的主机孵育架个数
UPS Communication Port	UPS与系统计算机通讯接口，默认值为3
Bar code Reader Commu-nication Port	条码扫描仪与系统计算机通讯接口，默认值为2
Automatic Report Time	每日自动打印时间设定
Send to Printer	自动打印功能是否执行设定
Anonymous Override	系统设定当匿名瓶存在时是否可先执行其他操作

续表

项目	功能
Alarm Sound Positive	设定发现阳性瓶时是否有报警声
Default Protocol Length-General	设定除Mycosis与Myco/F Lytic以外的培养瓶培养周期，默认值为5天，可设定范围为5～30天
Default Protocol Length-Mycosis-IC	设定Mycosis培养瓶培养周期，可设定范围为5～42天
Default Protocol Length- Myco/F Lytic	设定Myco/F Lytic培养瓶培养周期，默认值为5～42天，建议酵母菌为7天，真菌为30天，分枝杆菌为42天
Show Relative Vials	控制取出阳性瓶时相关瓶位的瓶位指示灯指示功能
Batch Negative Remove	设定是否成批取出阴性瓶
Accession Barcoding	设定是否可以利用院内条码输入样本号
Re-Entry of Positive	取出的阳性瓶3小时内是否具有重新放回功能

b.手工方式（F9）：当条码扫描仪损坏时可以利用手工方式操作。

a）按F9进入手工操作界面，界面指示与条码面板相同。

b）选择所需功能，并确认。

c.数据备份（F5）：建议用户每天做数据备份，每天一张软盘，可循环使用。

a）按F5，进入数据备份界面。

b）插入软盘，按F10，计算机提示完成拷贝的百分率。

d.备份数据回输（F7）

a）按F7进入备份回输界面。

b）插入备份软盘，按F10开始回输。

c）计算机提示回输结束。

④维护菜单（F9 Maintenance）：维护菜单提供瓶位封闭与解封功能。

a.瓶位封闭（F5 Block Station）：用于将损坏的瓶位封闭，系统将不会在新瓶登录时使用该瓶位。

b.瓶位解封（F3 Clear Blocked Station）：在将瓶位修复后解开封闭的瓶位，系统在新瓶登录时可以提供此瓶。

4.结果报告

（1）阳性结果多级报告制

1）当日报告：阳性血培养结果非常重要，应该立即口头报告给临床医生，包括：革兰染色特征和形态，报警时间、血培养阳性的瓶数和其他的鉴定信息（如革兰阳性球菌疑似为葡萄球菌等）。报告之前，应该回顾一下患者近期送检标本中微生物培养情况，这些结果有助于解释感染微生物的来源。同时记录报告的日期、时间、内容以及接受报告人的姓名。

2）次日报告：第2天，35℃中孵育18～24小时后，一方面向临床报告初步的、非标准抗生素敏感试验结果，同时做细菌鉴定及标准的抗生素药敏试验。

3）最终报告：第3天，35℃中孵育18～24小时后，最终向临床正式报告细菌种或属和标准抗生素敏感试验结果。

（2）阴性结果报告：普通血培养4天无细菌生长可报告为：“4天培养无细菌生长”，但培养瓶要继续培养至7天，如果发现有菌生长，可发补充报告。怀疑有真菌或其他慢生长菌，应延长至14～30天。

5.质量控制

（1）全自动血培养系统的孵箱、机器进样孔或分析组件应按照厂商的规定标准进行检测，所有维护、保养程序应定期进行。

（2）3D血培养仪质控报警时需对进样孔用标准棒作质控检测，不能通过时与厂家联系。

（3）仪器兼有培养箱的作用，每日记录其温度。

【参考范围】

正常人血培养应为阴性，即血瓶中无菌生长。

【参考文献】

1.陈东科，孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱，北京：人民卫生出版社，2011

2. Murry PR. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington D.C.:ASM Press，2003

3.组织标本的微生物检验

【临床意义】

在正常人体中，各种组织均属于无菌标本，有感染的情况下检出细菌，应视为病原菌，需给予及时正确的治疗，但是需要考虑标本是否受到污染，并应结合患者的病情综合分析。

【标本要求】

1.需用药之前，或停止用药后1～2天采集标本。

2.标本应严格无菌取材，标本量为1mm³即可，置无菌小瓶内，瓶内可加入少许无菌生理盐水，切勿加入甲醛溶液，尽快送到实验室，以提高检出率。

3.瓶上无盖、裂缝、均为不合格标本。

【原理】

普通培养、厌氧培养、涂片。正常人体中，各类组织均是无菌的，标本中检出的微生物，应视为病原菌。但应排除标本污染的可能。直接涂片可快速、准确地向临床提供细菌染色情况，指导临床用药。由于厌养菌在这些感染中占有一定比例，所以组织标本除了做一般细菌培养外，还应做厌养菌培养。

【仪器】

1. 35℃孵箱、44℃孵箱。

2.BD Phoenix全自动微生物鉴定／药敏分析仪。

3.Vitek compact全自动微生物鉴定仪。

4.BacT/Alert 3D血培养仪（系法国生物梅里埃公司）。

【试剂与材料】

1.中国蓝平皿、血平皿、巧克力平皿。

2.厌氧袋（气体发生袋、指示条）。

3.各种手工鉴定小管、氧化酶纸片、触酶（15%H₂O₂）、金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验。

4.配套微生物鉴定仪的鉴定／药敏卡。

5.API 20A试剂条鉴定（法国生物梅里埃公司）。

6.无菌研磨器。

【操作步骤】

1.普通培养组织标本经研磨后接种于血平皿、巧克力平皿、中国蓝平皿、营养肉汤或注入需氧培养瓶增菌等，置35℃孵箱培养过夜，根据生长在不同平皿上的不同菌落特点，做革兰染色、手工鉴定或上微生物生化鉴定卡一药敏试验一报告结果。

2.厌氧培养将组织标本经研磨后直接种于厌氧血平皿，密封于厌氧袋中，其中放厌氧指示条和厌氧产气袋，37℃培养48小时，同时接种于厌氧血培养瓶中，机器报警，长菌后转种厌氧血平皿.标本生长菌落后，做革兰染色、触酶试验（15%H₂O₂）、耐氧试验，确定为专性厌氧菌后使用API 20A试剂条鉴定，读取报告结果。

3.涂片检查组织标本经研磨后涂片，自然干燥，固定后做革兰染色、抗酸染色、六胺银染色等，根据染色细菌的形态，初步报告，提示感染细菌的种类。

4.脑脊液的微生物检验

【临床意义】

1.细菌性脑膜炎是一组病情较严重的急性感染性疾病，由多种致病菌引起。

2.除因结核杆菌引起的脑膜炎称为非化脓性脑膜炎，其他细菌引起的脑膜炎，因可对脑膜引起化脓性改变，统称为化脓性脑膜炎，其死亡率较高。

3.CSF中长出任何菌都是致病菌。做脑脊液培养时，建议同时做血培养。根据细菌种类的不同做不同的生化反应，不同的药物敏感试验，然后报告结果。

4.CSF墨汁染色涂片是隐球菌性脑膜炎诊断最简便而又迅速的诊断方法，阳性率约占70%。虽然培养是确诊的“金标准”，但阳性率并不高。故培养阴性者不能除外诊断。

5.实际中CSF革兰染色的敏感性仅达40%～60%。培养75%～85%的病例为阳性，而在先期接受抗生素治疗者中阳性率可＜50%。

6.新型隐球菌见于自然界鸽粪中，及免疫受损患者中，可引起机会致病性真菌感染。故应忌食腐烂水果，防止吸入带鸽粪的尘埃。

7.脑膜炎诊断一旦成立应及早治疗，一般认为早期有效的抗生素治疗可提高生存率并减少神经性后遗症。一些专家建议于患者人院后30分钟内开始抗生素治疗。

【标本要求】

最好用药之前采集标本1～2ml置无菌瓶内。脑脊液标本在常温下15分钟内送到实验室。不可放置冰箱，否则会使病原菌死亡。如果仅采集到一管脑脊液，应首先送到微生物室。由于脑膜炎奈瑟菌离体后容易自溶，流感嗜血杆菌对寒冷和干燥敏感易死亡。故不论是做涂片还是培养均必须立即送检。

【方法与原理】

脑脊液的细菌学检查对于细菌性脑膜炎的病原学诊断很有价值，同时有助于浆液性脑膜炎或无菌性脑膜炎的鉴别诊断。脑脊液通常是无色透明的，绝对无菌的。多种病原微生物可侵入脑脊液而引起疾病。

【仪器】

1.Cytospin3甩片离心机。

2.2. 35℃CO₂孵箱、44℃孵箱、30℃孵箱。

3.BD Phoenix全自动细菌鉴定／药敏系统。

4.Vitek Compact全自动微生物鉴定仪。

【试剂及材料】

1.中国蓝琼脂平皿、血琼脂平皿、巧克力平皿、脑膜炎半固体（增菌管）。

2.各种手工鉴定小管、氧化酶纸片、H₂O₂酶、金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验。

3.各种微生物鉴定卡。

【操作步骤】

1.墨汁染色脑脊液（CSF）置于Cytospin3甩片机的小管中离心5分钟（2000转／分钟），将已集中、直接甩到玻片上的沉淀物做墨汁染色，显微镜下可在黑色背景中看到圆菌体周围有较厚透明的荚膜，胞内有特殊结构，有时可见出芽的酵母菌，报告墨汁染色阳性，找到隐球菌属。

2.革兰染色 CSF置于Cytospin3甩片机的小管中，离心5分钟（2000转／分钟），将已集中、直接甩到玻片上的沉淀物做革兰染色，根据革兰染色的细菌形态，初步报告提示感染细菌的种类，隐球菌经革兰染色后类似淋巴细胞应注意区分，可进一步做墨汁染色确认。

3.细菌培养（表3-3）。

表3-3 脑脊液中常见的病原微生物

球菌		杆菌		其他
革兰阳性	革兰阴性	革兰阳性	革兰阴性
葡萄球菌 B群链球菌 A群链球菌肺炎链球菌肠球菌消化链球菌	脑膜炎奈瑟菌卡他莫拉菌	炭疽芽胞杆菌结核分枝杆菌产单核李斯特菌产气荚膜杆菌	流感嗜血杆菌大肠埃希菌产气肠杆菌肺炎克雷伯菌假单胞菌不动杆菌多杀巴斯德菌拟杆菌无色杆菌脑膜败血性黄杆菌	新型隐球菌白色念珠菌病毒寄生虫钩端螺旋体

（1）肺炎链球菌：CSF接种中国蓝平皿、血平皿、巧克力平皿，放在35℃的CO₂孵箱过夜培养，标本量足够时可注入儿童血培养瓶增菌。在血平皿、巧克力平皿上生长有草绿色溶血环，并呈脐窝状做OP试验（Optochin纸片），35℃的CO₂孵箱过夜培养（18小时以上），卡尺测量纸片直径≥14mm为阳性，做药敏时应使用含5%羊血的MH培养基，并在含5% CO₂的孵箱中35℃孵育20～24小时。

（2）脑膜炎双球菌：CSF接种中国蓝平皿、血平皿、巧克力平皿，放在35℃的CO₂孵箱过夜培养，标本量足够时可注入儿童血培养瓶增菌。在巧克力平皿上生长的光滑、湿润、无色素、菌落易乳化的革兰阴性双球菌，菌体呈肾形排列，氧化酶（+）、葡萄糖（+）、麦芽糖（+）、蔗糖（-）或Vitek Compact的NH卡鉴定此菌，本菌需测试β内酰胺酶，应在生物安全柜中操作。做药敏时应使用含5%羊血的MH培养基，并在含5% CO₂的孵箱中35℃孵育20～24小时。

（3）流感嗜血杆菌：CSF接种中国蓝平皿、血平皿、巧克力平皿，放在35℃的CO₂孵箱过夜培养，仅在巧克力平皿上生长的无色、透明、湿润的菌落，做卫星试验（+），X因子（一），V因子（-），X+V因子（+），本菌需测试β内酰胺酶，做药敏时应使用含HTM培养基，并在含5% CO₂的孵箱中35℃孵育16～18小时。

（4）72小时不生长，视为阴性，报告细菌培养无菌生长，如果条件允许最好能继续培养至5天甚至更长时间。

（5）隐球菌性脑膜炎

1）墨汁染色。

2）乳胶凝集试验。

3）真菌培养：CSF→塞保罗平皿→30℃孵箱培养3～7天→酵母菌作真菌鉴定（API 20C）→真菌药敏→报告结果。7天不长，视为阴性，报告真菌培养无菌生长。

5.穿刺液标本的微生物检验

【临床意义】

1.在正常人体中，胸腹水、关节液等穿刺液均属于无菌体液，有感染的情况下检出细菌，应视为病原菌，需给予及时正确的治疗。

2.细菌性胸膜炎金黄色葡萄球菌为主要致病菌，其次为革兰阴性菌和厌养菌感染及其他链球菌如肺炎链球菌、化脓性链球菌等的感染。开放性脓胸常有铜绿假单胞菌及变形杆菌的污染。

3.腹膜炎婴儿发病慢，儿童发病急，成人病变主要见于肝硬化腹水者，发病缓慢。

4.常见病原菌为大肠杆菌和厌养菌。腹腔感染微生物特点是培养的结果多提示混合菌生长，两种以上需养菌和厌养菌。感染超过48小时，即应使用抗厌养菌抗生素。多种细菌混合感染的病例越来越多。

5.关节液化脓性关节炎，多见于儿童及青少年，好发部位为髋关节和膝关节。主要致病菌为葡萄球菌和链球菌（60%为肺炎链球菌和化脓性链球菌）。化脓性关节炎的诊断主要依据革兰染色和培养，对于属于特定人群和年龄段的患者进行淋菌培养。对于亚急性的关节炎，可进行结核菌和真菌的培养。

【标本要求】

1.穿刺液（胸水、腹水、关节液、心包液等）。需用药之前，或停止用药后1～2天采集标本。

2.标本应严格无菌穿刺，标本量为1～5ml，置无菌小瓶内，常温下15分钟应送到实验室，以提高检出率。

3.对疑有淋病性关节炎患者的关节液，采集后应立即送检。

4.瓶上无盖、裂缝、均为不合格标本。

【原理】

普通培养、厌氧培养、涂片。正常人体中，穿刺液（胸水、腹水、心包液、关节液）均是无菌的，标本中检出的微生物，应视为病原菌。但应排除标本污染的可能。直接涂片可快速、准确地向临床提供细菌染色情况，指导临床用药。由于厌养菌在这些感染中占有重大比例，所以除做一般细菌培养外，还应做厌养菌培养。

【仪器】

1.Cytospin3甩片机。

2.BD Phoenix全自动微生物鉴定／药敏分析仪。

3.Vitek Compact全自动微生物鉴定仪。

4.BacT/Alert 3D血培养仪（系法国生物梅里埃公司）。

5. 35℃孵箱、44℃孵箱。

【试剂与材料】

1.用英国OXOID公司的产品制作的各种培养皿：中国蓝平皿、血平皿、巧克力平皿。

2.厌氧袋（气体发生袋、指示条）。

3.各种手工鉴定小管、氧化酶纸片、触酶（15%H₂O₂）、金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验。

4.配套微生物鉴定仪的鉴定／药敏卡。

5.API 20A试剂条鉴定（法国生物梅里埃公司）。

【操作步骤】

1.普通培养胸腹水、关节液等接种于血平皿、巧克力平皿、中国蓝平皿、或接种需氧血培养瓶增菌，置35℃孵箱培养过夜，根据生长在不同平皿上的不同菌落特点，做革兰染色、手工鉴定或上BD Phoenix微生物生化鉴定卡→药敏试验→报告结果。

2.厌氧培养胸腹水、关节液等接种于厌氧血培养瓶中，机器报警，长菌后转种厌氧血平皿，或将标本直接种于厌氧血平皿，密封于厌氧袋中（其中放厌氧指示条和厌氧产气袋），37℃培养48小时。生长菌落后，做革兰染色、触酶试验（15%H₂O₂）、耐氧试验，确定为专性厌氧菌后使用API 20A试剂条鉴定（法国生物梅里埃公司），读取报告结果。

3.直接涂片胸腹水、关节液等使用Cytospin3甩片机，2000转／分钟离心5分钟，将直接甩在玻片上的集菌沉淀物自然干燥，固定后做革兰染色，根据染色的细菌形态，初步报告：提示感染细菌的种类（表3-4）。

表3-4 穿刺液标本中常见的病原微生物

球菌		杆菌		其他
革兰阳性	革兰阴性	革兰阳性	革兰阴性	放线菌
葡萄球菌属肠球菌属草绿色链球菌厌养性链球菌肺炎链球菌 A群链球菌	淋病奈瑟菌	结核分枝杆菌类白喉杆菌产气荚膜杆菌炭疽杆菌梭杆菌	大肠杆菌肺炎克雷伯菌臭鼻克雷伯菌拟杆菌假单胞菌属肠杆菌属变形杆菌沙门菌不动杆菌	诺卡菌真菌

6.导管的微生物检验

【临床意义】

1.导管作为血管异物，长期使用致纤维素沉积、激活凝血系统、在管的尖端形成纤维凝血块，黏附于静脉壁，导致血栓形成。若细菌侵入并繁殖生长，极容易合并化脓性栓塞性静脉炎，并可导致导管败血症。

2.导管源性感染应做导管近端培养，再加血培养，因为当接受导管治疗的患者有不明原因的发冷、发热时，应首先考虑导管感染或败血症，此时应及时采血培养及导管近端培养，有助于明确病原。

3.重症患者需要导管检查、监护、全胃肠外营养（TPN）治疗，因此导管源性感染和导管源性败血症的发病率明显上升。长时间留置静脉导管后，静脉炎的发生率为13%～39%。

【标本要求】

用无菌剪刀剪取静脉插管、内置导管等导管的近端，放于无菌瓶中（2～4cm）立即送检。任何静脉或血管导管处的脓液及若有深部感染性血栓，则应拔除导管，并做涂片和培养。

【方法与原理】

细菌培养。在血平皿上导管的滚动区内如有细菌生长，即可计数、鉴定及进行药敏试验。

【仪器】

1.BD Phoenix全自动鉴定／药敏系统。

2.Vitek Compact全自动微生物鉴定仪。

3.CO₂孵箱、44℃孵箱、35℃普通孵箱。

【材料】

1.血平皿。

2.各种手工鉴定小管、氧化酶纸片、H₂O₂酶、金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验。

3.各种微生物鉴定卡。

【操作步骤】

1.用无菌镊子夹起导管标本1段，放置在血平皿的边缘，一次性从一边滚动到另一边，然后盖朝上放置于35℃孵箱培养过夜。长菌后，分别做导管尖和导管尾的菌落计数、生化鉴定、药敏试验、报告结果。

2.若导管尖培养阳性（≥15个集落单位），则可能为导管相关性脓毒血症。若导管尖培养阴性，而尾部阳性，其意义不明确。

3.如果48小时未生长细菌，即报普通培养无菌生长。

4.导管标本中常见微生物见表3-5。

表3-5 导管标本中常见微生物

革兰阳性	革兰阴性	其他
凝固酶阴性葡萄球菌金黄色葡萄球菌肠球菌	大肠杆菌克雷伯菌念珠菌不动杆菌肠杆菌属假单胞菌沙雷菌	真菌分枝杆菌

7.尿液标本的微生物检验

【临床意义】

1.尿液标本的细菌培养检查对于膀胱和肾脏感染的早发现和病原学诊断很有价值，可以反映肾脏、膀胱、尿道、前列腺等处的炎症变化，帮助临床医师选择性用药，以减少因用药不当造成的耐药菌株增加。

2.诊断泌尿系感染的细菌学标准是：菌落计数≥10⁵ cfu/ml，才有诊断价值，1000以下者多为体外污染无临床意义。

3.在脓尿男性患者中，病原体生长≥10³ cfu/ml即有意义。

4.如果尿菌落计数低于此标准，并不能完全排除尿路感染。这多见于以下几种情况：

（1）应用抗菌药物，尿中细菌生长受到抑制。

（2）尿频时，膀胱内细菌停留时间短而细菌数量则少。

（3）采尿时，外阴部的消毒剂混入尿中。

（4）病原菌生长要求条件高，尿中细菌受营养条件限制而繁殖受抑制。

5.如果怀疑是伤寒、副伤寒，一般在病程的2～3周做尿液培养检查，约有20%～30%患者的尿液中可以检查到伤寒沙门菌。

6.如果尿液中培养出两种以上细菌，即使每毫升细菌大于100 000个，亦应疑为污染，标本应重新送检。

7.治疗建议

（1）无症状性菌尿：尿中病原体＞10⁵ cfu/ml通常不需治疗。

（2）非复杂性泌尿系感染：应行尿培养并选用2周的抗生素治疗方案。

（3）复杂性泌尿系感染：治疗通常需要2周并根据尿培养结果调整方案。

（4）儿童泌尿系感染：感染可以引起肾脏不可逆的瘢痕形成，这是儿童时期泌尿系感染的一个严重的远期后遗症。为预防这一后遗症的发生，强调早期明确诊断，迅速使用抗生素治疗并对疗效及时予以评价。

【标本要求】

1.尿液标本的采集和培养中最大的问题是污染杂菌，故应严格进行无菌操作留取清洁中段尿。

2.先用肥皂水清洗，再用无菌水冲洗。留取10ml清洁中段尿于无菌小瓶中立即送检。亦可留取袋尿，导管尿或无菌手续穿刺取尿。

3.多数药物均通过尿液排泄，因此，采集尿液均宜在用药前进行。

【方法与原理】

用1μl定量接种环于血平皿上密集画线，1μl尿液所生长的菌落数乘以1000，即为每ml的菌落数（cfu/ml）。正常人尿液通常是无菌的，尿液从尿道排出时可能受到尿道中细菌的污染，但中段尿细菌数不会太多，临床上以细菌数≥10⁵ cfu/ml，作为诊断泌尿系感染的重要指标。

【仪器】

1. 35℃孵箱、44℃孵箱。

2.BD Phoenix全自动细菌鉴定／药敏系统。

3.Vitek Compact全自动微生物鉴定仪。

【试剂与材料】

1.中国蓝平皿、血平皿、1μl量接种环、生化鉴定管。

2.各种手工鉴定小管、氧化酶纸片、H₂O₂酶、金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验。

3.各种微生物鉴定卡。

【操作步骤】

1.用1μl接种环取尿液分别在中国蓝平皿上分区画线并血平皿上密集画线，37℃培养过夜，血平皿有菌落生长→做菌落计数（cfu／ml）、细菌鉴定、药敏试验。

2.无细菌生长时延长培养48小时，发最终报告：“尿普通培养无菌生长”。

3.培养结果解释见表3-6（G^-：革兰阴性菌；G⁺:革兰阳性菌）。

表3-6 尿液培养结果解释

单种菌				两种菌（A+B）					两种菌
G^-或 G⁺	G^-或 G⁺	G^-或 G⁺	酵母菌	A：G^- 或G⁺ B：G^- 或G⁺	A：G^- 或G⁺ B:G^- 或G⁺	A: G^- 或G⁺ B:G^- 或G⁺	A:G^- 或G⁺ B：酵母菌少	A:G^- 或G⁺ B：酵母菌	*
cfu/ml	＞10⁵	10⁴～10⁵	＜10⁴	少/中/ 大量	A＞10⁵ + B＜10⁴#	A＞10⁵ + B:10⁴～ 10⁵	A＞10⁵ + B＞10⁵	10⁵ 或：10⁴ ～10⁵ B:-	A＜10⁵# + B：少／中／大量	*
鉴定	是	是	否	是	A:是 B：否	A:是 B：是	A:是 B：是	A:是 B：否	A:否 B：是
药敏	是	是	否	一（大量时需做药敏）	A:是 B：否	A:是 B：是	A:是 B：是	A:是 B：否	A:否 B：否

#报告有1、2或3种其他菌＜10⁴ cfu/ml，可能污染；*报告“有两种以上细菌生长，请重复送检”，保留培养皿，如果在重复送检的标本中有相同的细菌生长，有意义的细菌或菌量大的细菌都要做鉴定和药敏

污染菌：革兰阳性芽胞杆菌，类白喉群，非D群的草绿色链球菌和乳杆菌属多为污染菌

4.尿标本中常见的细菌见表3-7。

表3-7 尿标本中常见病原菌

革兰阳性菌	革兰阴性菌
肠球菌属金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌厌氧链球菌化脓性链球菌无乳链球菌结核分枝杆菌白念珠菌光滑念珠菌	大肠埃希菌肺炎克雷伯菌产气肠杆菌铜绿假单胞菌沙门菌属变形杆菌属沙雷菌属不动杆菌属阴道加德纳菌淋病奈瑟菌

8.痰细菌培养的前处理

【标本要求】

1.肉眼观察，并记录标本外观

（1）唾液。

（2）带血。

（3）黏液样。

（4）水样。

（5）黏液脓性。

（6）脓性。

（7）脓性黏液样。

拒收“唾液”标本，“并写明此标本不适合试验”。

2.显微镜检查

（1）取标本的脓性部分涂片（最好在60℃下固定涂片，并紫外线照射30分钟）。

（2）革兰染色。

（3）低倍视野（×100）下观察涂片。

（4）记录低倍视野下细胞数（5个视野的平均数），如果镜检显示上皮细胞＞25个／低倍镜视野，应报告“非下呼吸道标本”，重新留取标本。

【试剂】

Sputasol溶液

1.每瓶Sputasol溶液成分

（1）二巯基乙醇0.10g。

（2）NaCl 0.78g。

（3）KCl 0.02g。

（4） Na₂HPO₄ 0.112g。

（5）KH₂PO₄ 0. 02g。

2.Sputasol溶液配制用无菌操作加5ml的无菌蒸馏水至含Sputasol的瓶内，轻轻混匀至粉剂完全溶解，再加入95ml无菌蒸馏水至溶解后的Sputasol的瓶内，摇均，即为工作浓度的Sputasol溶液。工作浓度的Sputasol溶液立即使用，或2～8℃下只可贮存48小时。

【操作步骤】

痰标本常规液化：用巴斯特吸管加等量的工作浓度的Sputasol溶液至痰标本中摇动混合，置37℃温箱内孵育，定期摇动直至痰液完全液化。1500转／分钟离心5分钟，弃上清，取少量沉淀物涂于血琼脂平皿、巧克力（加抗生素）琼脂平皿和中国蓝琼脂平皿上并分区画线，置37℃孵箱内孵育18～24小时。

9.下呼吸道标本的处理和微生物检验

【标本要求】

1.最好在应用抗生素前采集标本。

2.可接受的标本痰（以晨起后采集为佳，深咳痰，勿唾液）、气管及支气管吸取物、支气管肺泡灌洗液、支气管毛刷、支气管活检、肺抽吸液或肺穿刺活检。

（1）痰标本采集：清晨嘱患者深咳收集第一口痰，采集前嘱患者漱口，有义齿的患者应先取下义齿。将标本直接咳人无菌标本杯中，旋紧杯盖，防止泄漏。真菌和结核杆菌培养应连续3个早晨采集标本。标记患者信息，注明需做何种培养，如：细菌培养、抗酸杆菌或真菌培养。采集、运送结核杆菌标本时应特别注意安全防护。儿童要求同成人。

（2）气管吸取物采集：通过气管内插管采集标本，用注射器或抽吸装置吸取分泌物。防止生理盐水过分稀释标本。标记患者信息，标本确切来源、初步诊断及患者抗生素使用情况。

（3）支气管镜采集：标本采集患者取仰卧位。吸入麻醉并用利多卡因凝胶润滑双侧鼻孔。也可通过静脉输入镇静剂以耐受气管镜检查。经鼻插入气管镜取材。

（4）鼻咽部标本采集：以无菌拭子进入鼻腔内至少1cm后再采集标本。鼻内有病灶时，取样时先用力旋转拭子，然后停留10～15秒，推出拭子，放入运输培养基。标记患者信息，注明鼻内是否有病灶。该标本不能用于检测鼻窦、中耳或下呼吸道感染。

（5）咽喉标本采集：用压舌板压住舌头，观察喉后部和扁桃体区域（急性咽炎病原体往往富集于这些部位），定位炎症和渗出物区域。将拭子用力擦拭多个区域的渗出物或扁桃体及咽后部。拭子取出口腔时，不要碰及脸颊、牙齿、牙龈。将拭子放入运输培养基（若用于诊断A群链球菌咽炎，则应用改良Stuart培养基的运输拭拭子运送）。标记患者信息，采集时间。注明患者目前使用抗生素情况、标本检测要求、其他需要检测的病原体，如淋病奈瑟菌。

3.下呼吸道标本应在采集后立即送至细菌室，并于1小时内接种，室温卞放置＞2小时会降低肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的分离率，而定植于上呼吸道的非致病菌则过度生长。特别注意：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌不耐低温，下呼吸道标本勿冷藏。

4.不可接受的标本唾液样的痰，24小时收集的痰、咽拭子。

【方法与原理】

由于受上呼吸道标本的污染，诊断下呼吸道感染较为复杂。因此实验室必须确定合格的标本来源。标本应当革兰染色后显微镜镜检以保证质量。

【仪器】

普通光学显微镜、CO₂培养箱。

【试剂】

1.血琼脂平皿、巧克力琼脂平皿（加抗生素）、中国蓝琼脂平皿。

2.脑心浸液肉汤（BHI）：介入性操作获得的标本，如抽吸液和活检标本。

【操作步骤】

1.下呼吸道细菌学标本的涂片检查所有下呼吸道标本必须进行涂片革兰染色镜检，评价痰标本质量，注意白细胞内有无吞噬的细菌，合格痰标本应当记录所见细菌等病原体情况。记录细菌要求：按革兰阳性或阴性、球菌或杆菌等分别记录平均每油镜视野中细菌的大致数量。形态学上明显不同的革兰阴性杆菌或有意义的阳性球菌，应分别记录。

（1）所有痰标本必须记录外观、性状如脓痰、黏液脓痰、黏痰、水样泡沫、血性等。同时记录平均每低倍镜视野下鳞状上皮细胞、白细胞数量。下呼吸道灌洗或刷检标本，如有柱状上皮细胞，应分别记录。

（2）细胞学筛选方法：选择标本的脓性部位或带血部分涂成均匀薄片。

（3）涂片检查应挑选痰中脓性或带血部分，涂成均匀薄片，革兰染色，低倍镜下观察。评价痰标本质量的方法见表3-8。不合格的痰标本，实验室应立即通知临床重新留痰送检。在涂片中如有柱状上皮细胞不应计数于鳞状上皮细胞中，应注明其数量，作为合格标本对待。

表3-8 痰标本显微镜检查的分类

分类*	细胞数	／低倍镜
分类*	WBC	鳞状上皮细胞
6 5 4 3 2 1	＜25 ＞25 ＞25 ＞25 10～25 ＜10	＜25 ＜10 10～25 ＞25 ＞25 ＞25

注：*分类中1～3类不做培养，要求重新留取标本；4、5类为合格标本；6类为气管穿刺液时，如未见白细胞，而鳞状上皮细胞＞10/低倍，亦应重新留取标本

2.下呼吸道标本的细菌培养

（1）标本培养前的处理：不含或含黏液很少合格标本，可直接接种。遇有含大量黏液的标本，应加入等量液化剂Sputasol（一种商品化的痰液溶解剂），作用20分钟溶解黏痰，使痰液均质化后接种。

（2）分离培养：将处理后的痰液接种于血琼脂平皿、巧克力琼脂平皿和中国蓝琼脂平皿，接种后置于5%～10%CO₂中，35℃培养18～24小时，并根据菌落及形态特点作出初步判断并进行纯分离及生化鉴定。如24小时无细菌生长应再培养24小时，再观察菌落生长情况，如仍无生长则定为阴性。

（3）痰半定量：即用接种环将痰液在血平皿和巧克力平皿上按规定划线要求作三区划线接种标本进行培养。三区划线方法：首先用棉签把经Sputasol溶解的痰液蘸取（或将接种环通过火焰灭菌，冷却后挑取标本少许，尽量取有脓或血的部位），然后将其涂布在平板第一区，并作数次划线，再在二、三区依次用接种环划线，每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。半定量痰培养的临床意义见表3-9。

表3-9 痰标本细菌培养半定量结果判定标准及临床意义

级别	划线区菌落数目			相当菌落数	临床意义
级别	第一区	第二区	第三区	（cfu/ml）
1+（极少量） 2+（少量） 3+（中量） 4+（多量）	＜10 ＞10 ＞10 ＞10	＜5 ＞5 ＞5	＜5 ＞5	≤10⁴ 10⁵ 10⁶ ≥10⁷	多为污染菌污染可能大，建议重复培养（重复培养：1+:污染：2+:难定：3+:感染菌）感染可能大，建议重复培养（重复培养：2～3+：感染菌）多为感染病原菌

3.其他下呼吸道标本的处理介入性操作获得的标本是非常“宝贵的”，应当按图3-1尽快、并正确处理。

（1）支气管、肺泡灌洗液：接种血琼脂平皿、中国蓝琼脂平皿，加万古霉素的巧克力琼脂平皿，如医生有特殊要求可加种含庆大霉素的血琼脂平皿。血琼脂平皿和加万古霉素巧克力琼脂平皿用10μl计数接种环取标本沿三个方向密涂；中国蓝琼脂平皿划线，CO₂孵箱35℃孵育18～24小时，如24小时无菌生长继续孵育至48小时。

（2）支气管保护性毛刷：在1ml无菌生理盐水中清洗毛刷，摇匀振荡30秒，毛刷洗液接种血琼脂平皿、中国蓝琼脂平皿，加万古霉素的巧克力琼脂平皿，如医生有特殊要求可加种含庆大霉素的血琼脂平皿。血琼脂平皿用10μl计数接

图3-1下呼吸道标本处理

种环取标本沿三个方向密涂；中国蓝琼脂平皿和加万古霉素巧克力琼脂平皿三区划线，CO₂孵箱35℃孵育18～24小时，如24小时无菌生长继续孵育至48小时。

（3）真菌培养：接种沙保弱琼脂斜面，28℃孵育7～14天。

（4）结核分枝杆菌培养：接种罗氏培养管，35℃孵育60天。

（5）诺卡菌培养：接种血琼脂平皿，三区划线，35℃孵育7天。

（6）涂片：涂片类型遵医嘱，包括革兰染色、抗酸染色、真菌涂片、六胺银染色涂片。

毛刷涂片：革兰染色、抗酸染色、真菌涂片、PCP涂片。

（7）菌落计数：血琼脂平皿上的菌落数×100cfu/ml（稀释倍数）。

4.细菌学检查结果判定

（1）确认病原体

1）合格咳痰标本培养分离到致病菌或条件致病菌（主要包括肺炎球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、金黄色葡萄球菌，A群链球菌等）呈中度以上生长（半定量细菌浓度≥3+）。

2）胸水培养到病原菌。

3）经纤维支气管镜或人工气道吸引的下呼吸道标本培养到浓度≥10⁵cfu／ml（半定量浓度2+）的致病或条件致病菌。

4） BALF标本培养到浓度≥10⁴ cfu/ml的致病菌或条件致病菌。

5） PSB或防污染BALF培养到浓度≥10³ cfu/ml的致病菌或条件致病菌。

（2）可疑病原体

1）合格痰标本培养分离到的条件致病菌（主要包括革兰阴性杆菌和金黄色葡萄球菌）呈轻中度生长（半定量细菌浓度为2+）。

2）合格痰标本培养分离到肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、A群链球菌等呈轻中度生长（半定量细菌浓度为1+或2+）。

3）每天咳痰收集的合格痰标本连续3次培养分离到相同的条件致病菌（主要包括革兰阴性杆菌和金黄色葡萄球菌）。

（3）非病原体：痰培养分离到属于上呼吸道正常菌群的细菌（草绿色链球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、微球菌、非溶血性链球菌、非致病奈瑟菌、类白喉杆菌等）或不符合上述两个条款中任何一项的情况，应认为没有检测到病原体。这些细菌不进行药敏试验。

5.下呼吸道感染的常见细菌革兰阳性细菌（肺炎链球菌、A群链球菌、金黄色葡萄球菌、厌氧球菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、放线菌、诺卡菌、酵母样菌、丝状真菌），革兰阴性细菌（卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、其他肠杆菌科细菌、假单胞菌属菌种、军团菌菌属菌种、多杀巴斯德菌）。

10.流感嗜血杆菌检验

【临床意义】

有荚膜b血清型流感嗜血杆菌致病性强，主要引起细菌性脑膜炎，也是伴有败血症急性会厌炎的主要致病菌，也可随血液引起化脓性关节炎、骨髓炎、蜂窝织炎、心包炎、亚急性心内膜炎和败血症。还可引起人类的呼吸道感染（急性咽炎、喉炎、气管炎、肺炎、中耳炎、鼻窦炎，慢性支气管炎急性发作）。

流感嗜血杆菌引起的感染的治疗，若β内酰胺酶阴性，则首选氨苄西林、阿莫西林，次选复方磺胺甲■唑，第二、三代头孢菌素，红霉素及氨曲南。口服用药有：阿莫西林／克拉维酸、阿奇霉素、克拉霉素、头孢克洛、头孢丙烯、头孢地尼、头孢泊肟及头孢呋辛等。β内酰胺酶阳性，提示对青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药。若患者患有危及生命的感染（如脑膜炎、菌血症等），则对血液和脑脊液分离的流感嗜血杆菌，常规必须报告氨苄西林、一种第三代头孢菌素、氯霉素和美罗培南的药敏结果。绝大多数耐氨苄西林和阿莫西林的流感嗜血杆菌分离株产TEM型β内酰胺酶。药敏试验显示流感嗜血杆菌对头孢呋辛、阿奇霉素、氨苄西林／舒巴坦、头孢噻肟的敏感率均很高。

【标本要求】

1.最好在应用抗生素前采集标本，取样后立即送检，防止干燥，35℃条件下保温送检，不可置冰箱保存。

2.留取痰、鼻咽拭子，以晨起后采集为佳。

3.血液、脊液、支气管肺泡灌洗液、气管抽出液、肺穿刺或活组织等。

【仪器】

CO₂培养箱。

【试剂与材料】

1.血平皿、巧克力平皿。

2.胰消化大豆琼脂。

3.X、V、X+V因子纸片（英国Oxoid公司）。

4.头孢硝噻吩（Nitrocefin）（法国生物梅里埃公司）检测β内酰胺酶。

5.加有抗生素的巧克力培养基（选择分离培养基）

6.药敏试验（HTM，Haemophilus Test Medium）培养基（Oxoid公司）。

【操作步骤】

1.流感嗜血杆菌培养及鉴定——卫星试验（satellite test）

（1）方法1：取可疑菌落密涂划种于血平皿和MH平皿上，再将金黄色葡萄球菌分别划线于血平皿或MH平皿中央。血平皿可提供流感嗜血杆菌生长所必需X因子，金黄色葡萄球菌可提供流感嗜血杆菌生长所必需的V因子。仅在血平皿上靠近金黄色葡萄球菌的菌落周围由大到小卫星状排列的现象判定为卫星试验阳性，而MH平皿上金黄色葡萄球菌的菌落周围无生长的菌落（MH平皿上接种金黄色葡萄球菌，只具备V因子），即具有此现象的嗜血杆菌为流感嗜血杆菌。在MH平皿上金黄色葡萄球菌的菌落周围也具有这种卫星现象的嗜血杆菌为非流感嗜血杆菌，因为后者不需要X因子。

（2）方法2：采用胰消化大豆琼脂平皿，将待测菌密涂于此平皿上，分别贴含有X、X+V、V因子的三种纸片。三种纸片间的距离尽可能远。培养24小时后，观察待测菌对X、V、X+V因子的需要情况。从而判定出是流感嗜血杆菌还是非流感嗜血杆菌。只有在X+V纸片周围出现卫星状生长的菌才可定为流感嗜血杆菌。

2.流感嗜血杆菌药敏实验 CLSI推荐的纸片法药敏为HTM培养基。Oxoid公司的药敏纸片，标准的接种量（0.5号麦氏比浊管），35℃5%～7%的CO₂环境中孵育，16～18小时读取结果。

3.质控菌流感嗜血杆菌ATCC49247，ATCC49766，大肠埃希菌ATCC35218（做阿莫西林／克拉维酸药敏时）。

【参考范围】

正常上呼吸道标本可检测到流感嗜血杆菌，其致病性需结合临床症状。