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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验71-80
作者:王泓 日期:2014-06-19
【临床意义】
阳性提示巨细胞病毒近期感染。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附实验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay，ELISA）。
2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被巨细胞病毒抗原成分的酶免疫反应板上，首先用含有欧蒙IgG／RF吸附剂的缓冲液稀释标本，去除标本中的IgG和RF，以检测特异性IgM。在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗巨细胞病毒抗原成分的抗体，则可以特异性地和酶免疫反应板上的巨细胞病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgM类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgM抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗巨细胞病毒抗原抗体浓度成正比，可根据试剂盒中标准血清测定结果半定量计算出患者标本中抗巨细胞病毒抗原抗体浓度。
【仪器】
瑞士TECAN公司SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
欧蒙公司，试剂盒组成如下：
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成分
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颜色
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规格
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代码
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1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可拆
分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（IgM，人），直接使用
3.阳性对照
（IgM，人），直接使用
4.阴性对照
（IgM，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM（兔），直接使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液0.5 mol/L硫酸，直接使用
|
—
浅红
蓝色
绿色
绿色
浅蓝
无色
无色
无色
|
12×8
1×2. 0ml
1×2. 0ml
1×2. 0ml
1×12ml
1×100ml
1×100ml
1×12ml
1×12ml
|
Strips
CAL 3
Pos controL
Neg control
Conj ugate
Sample buffer
Wash buffer 10×
Substrate
Stop solution
|
【操作步骤】
1.标本稀释 用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本。可取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀），室温静置30分钟。
2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgM）至每一微孔。
6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
7.清洗 同第4步骤清洗。
8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
11.比色 450nm比色波长，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
12.结果判定
半定量：按以下公式计算对照血清或患者标本吸光度与标准品吸光度的比值。
半定量估计结果：比值=对照血清或患者标本的吸光度值／标准品的吸光度值。
【参考范围】
1.标本抗巨细胞病毒抗体ISR值小于0.8为阴性；大于1.1是阳性；IRS在0.8到1.1之间是灰区。
2.结果在阳性或灰区的标本需用Trinity的巨细胞病毒抗体IgM诊断试剂盒进行复检。最终结果判断如下：
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欧蒙
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Trinity
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最终结果
|
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+
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+
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+
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|
+
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灰区
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灰区，建议复查
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+
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-
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-
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灰区
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+
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灰区，建议复查
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灰区
|
灰区
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灰区，建议复查
|
|
灰区
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-
|
-
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【临床意义】
HSVl-IgM抗体阳性提示HSV1近期感染。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附实验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay，ELISA）。
2.原理稀释后的待检血清滴加在包被单纯疱疹病毒（HSV-1）抗原成分的酶免疫反应板上，首先用含有IgG/RF吸附剂的缓冲液稀释标本，去除标本中的IgG和RF，以检测特异性IgM。在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗单纯疱疹病毒（HSV-1）抗原成分的抗体，则可以特异性地和酶免疫反应板上的单纯疱疹病毒（HSV-1）抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgM类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgM抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗单纯疱疹病毒（HSV-1）抗原抗体浓度成正比，可根据试剂盒中标准血清测定结果半定量计算出患者标本中抗单纯疱疹病毒（HSV-1）抗原抗体浓度。
【仪器】
瑞士TECAN公司SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
欧蒙公司，试剂盒组成如下：
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成分
|
颜色
|
规格
|
代码
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|
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可拆
分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（IgM，人），直接使用
|
—
浅红
|
12×8
1×2. 0ml
|
Strips
CAL 3
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续表
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成分
|
颜色
|
规格
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代码
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3.阳性对照
（IgM，人），直接使用
4.阴性对照
（IgM，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM（兔），直接使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液0.5 mol／L硫酸，直接使用
|
蓝色
绿色
绿色
浅蓝
无色
无色
无色
|
1×2. 0ml
1×2. 0ml
1×12ml
1×100ml
1×100ml
1×12ml
1×12ml
|
Pos control
Neg control
Conj ugate
Sample buffer
Wash buffer 10×
Substrate
Stop solution
|
【操作步骤】
1.标本稀释用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本。可取10μl血清用1. 0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀），室温静置30分钟。
2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgM）至每一微孔。
6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
7.清洗 如第4步骤清洗。
8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
9.温育室温（18～25℃）避光温育15分钟。
10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
12.结果判定
半定量：按以下公式计算对照血清或患者标本吸光度与标准品吸光度的比值。
半定量估计结果：比值一对照血清或患者标本的吸光度值／标准品的吸光度值。
【参考范围】
1.标本抗单纯疱疹1型病毒抗体ISR值小于0.8为阴性；大于1.1是阳性；IRS在0.8到1.1之间是灰区。
2.结果在阳性或灰区的标本需用Trinity的单纯疱疹1型病毒抗体IgM诊断试剂盒进行复检。最终结果判断如下：
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欧蒙
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Trinity
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最终结果
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+
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+
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+
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|
+
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灰区
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灰区，建议复查
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+
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-
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-
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灰区
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+
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灰区，建议复查
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灰区
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灰区
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灰区，建议复查
|
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灰区
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-
|
-
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【临床意义】
HSV2-IgM抗体阳性提示HSV2近期感染。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法酶联免疫吸附实验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay，ELISA）。
2.原理稀释后的待检血清滴加在包被单纯疱疹病毒（HSV-2）抗原成分的酶免疫反应板上，首先用含有IgG／RF吸附剂的缓冲液稀释标本，去除标本中的IgG和RF，以检测特异性IgM。在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗单纯疱疹病毒抗原成分的抗体，则可以特异性地和酶免疫反应板上的单纯疱疹病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgM类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgM抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗单纯疱疹病毒抗原抗体浓度成正比，可根据试剂盒中标准血清测定结果半定量计算出患者标本中抗单纯疱疹病毒抗原抗体浓度。
【仪器】
瑞士TECAN公司SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
欧蒙公司，试剂盒组成如下：
|
成分
|
颜色
|
规格
|
代码
|
|
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可拆
分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（IgM，人），直接使用
3.阳性对照
（IgM，人），直接使用
4.阴性对照
（IgM，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM（兔），直接使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液0. 5mol／L硫酸，直接使用
|
—
浅红
蓝色
绿色
绿色
浅蓝
无色
无色
无色
|
12×8
1×2. 0ml
1×2. 0ml
1 ×2. 0ml
1×12ml
1×100ml
1×100ml
1×12ml
1×12ml
|
Strips
CAL 3
Pos control
Neg control
Conj ugate
Sample buffer
Wash buffer 10×
Substrate
Stop solution
|
【操作步骤】
1.标本稀释 用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本。可取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀），室温静置30分钟。
2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgM）至每一微孔。
6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
7.清洗 如第4步骤清洗。
8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
12.结果判定
半定量：按以下公式计算对照血清或患者标本吸光度与标准品吸光度的比值。
半定量估计结果：比值=对照血清或患者标本的吸光度值／标准品的吸光度值。
【参考范围】
1.标本抗单纯疱疹2型病毒抗体ISR值小于0.8为阴性；大于1.1是阳性；IRS在0.8到1.1之间是灰区。
2.结果在阳性或灰区的标本需用Trinity的单纯疱疹2型病毒抗体IgM诊断试剂盒进行复检。最终结果判断如下：
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欧蒙
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Trinity
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最终结果
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+
|
+
|
+
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+
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灰区
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灰区，建议复查
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+
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-
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-
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灰区
|
+
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灰区，建议复查
|
|
灰区
|
灰区
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灰区，建议复查
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灰区
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-
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-
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【临床意义】
阳性提示单纯疱疹病毒1型和（或）2型急性感染。
【标本要求】
标本的采集和固定：挑破水泡，将拭子用力涂擦破损部位基底面以获得尽可能多的感染细胞，压挤方式滚动涂片，每份标本涂片2张，丙酮室温固定10分钟。
【方法与原理】
1.方法 直接免疫荧光法。
2.原理 荧光素标记的单克隆抗体滴加在涂片上，如果标本中存在单纯疱疹病毒1型或2型抗原，即与荧光单抗结合，否则被PBS洗去。结合荧光单抗的单纯疱疹病毒1型和2型感染细胞在荧光显微镜下呈荧光染色。
【仪器】
日本Nikon公司Diaphot-200荧光显微镜和德国Heidolph公司Paromax2020型洗涤摇床。
【试剂】
丹麦Dako公司产品，荧光素（FITC）标记的单纯疱疹病毒1型和2型单克隆抗体（IMAGEN-rM Herpes Simples Virus）。
【操作步骤】 将荧光素标记的抗单纯疱疹病毒1型和2型单克隆抗体分别滴加于临床标本涂片上（1型和2型各一孔），37℃湿盒内温育30分钟。PBS洗涤2次，每次2～3分钟，再用蒸馏水冲洗玻片1次，以除去盐分，电风扇吹干，封片后在荧光显微镜下（×200）观察结果。阳性结果可见细胞膜、细胞质或细胞核荧光染色。
【参考范围】
阴性。
【临床意义】
阳性提示麻疹病毒近期感染。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）。
2.原理 用纯化的麻疹病毒抗原包被微孔，将待检稀释血清标本加入微孔，若其中含抗麻疹病毒IgM，则与包被在微孔上的抗原结合。当微孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgM抗体，其与微孔中的抗麻疹病毒IgM结合，最后辣根过氧化物酶催化加入微孔的酶底物反应，呈现蓝色，加入终止液后呈黄色。使用酶标仪测定其吸光度值。
【仪器】
瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
Trinity公司，试剂盒组成如下：
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成分
|
规格
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代码
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1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可拆分的微孔，直接使用
2.校准液
需稀释
3.阳性质控
需稀释
4.阴性质控
需稀释
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM，直接使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
20倍浓缩
8.TMB/底物液
直接使用
9.终止液
直接使用
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12×8
1×0.4ml
1×0.04ml
1×0.4ml
1×16ml
2×45ml
1×60ml
1×15ml
1×15ml
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Antigenscoatedmicroassayplate
Calibrator
Positivecontrol
Negativecontrol
HRPconjugate
Serumdilutionplus
Washbuffersolutiontype
Chromogen/substratesolutiontype
Stopsolution
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【操作步骤】
1.实验前处理
（1）实验前将试剂盒和标本等放置在实验台平衡至室温（21～25℃），摇匀试剂盒内的各种试剂。
（2）将浓缩洗液（60ml）用蒸馏水稀释为1.2L工作洗液，混匀。
（3）待检血清标本，阳、阴性质控和校准物稀释：以1: 81用血清稀释液稀释（10μl标本+800μl血清稀释液）。脑脊液标本用稀释液以1：10稀释。
2.检测过程
（1）取出需要数量的微孔板条，第一条第一空设空白对照。
（2）在相应微孔中加入100μl稀释后的阳性、阴性质控，校准及患者标本。在空白孔中加入100μl血清稀释液。
（3）将微孔板置于21～25℃室温孵育（30±2）分钟。
（4）用洗板机洗涤微孔板条5次，每次浸泡20秒左右。
（5）洗毕后在纸巾上拍尽残余洗液。
（6）将所有微孔中加入100μl酶结合物（空白孔不加）。
（7）轻拍摇动微孔条，在21～25℃室温孵育（30±2）分钟。
（8）重复第4、5洗涤、拍干步骤。
（9）将所有微孔中加入100μl TMB底物液。
（10）轻拍摇动微孔条，21～25℃室温孵育（15±2）分钟。
（11）将所有微孔中加入100μl终止液，轻拍摇匀微孔条。
（12）5分钟后，1个时内用酶标仪（450nm波长）检测各孔吸光度。
（13）阴性质控吸光度应＜0. 250；校准应≥0.300；阳性质控应＞0. 250。阴性质控、阳性质控吸光值应在瓶外所标示范围内。
3.结果计算
（1）校准平均吸光度值=两校准孔吸光度值之和除以2。
（2）校准因子（用于校准由于室温和孵育时间的波动等引起的实验误差）见瓶标。
（3）临界值=校准平均吸光度值×校准因子。
（4）ISR值=标本吸光度值／临界值
如：校准OD分别为0.38和0.42
平均校准OD=0. 40
校准因子=0. 50
临界值=0. 50×0.40=0.2
患者标本OD=0. 60
ISR值=0.60/0.20=3.00
【参考范围】
|
ISR值
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结果
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解释
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＜0.9
0.91～1.09
＞1.10
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阴性
未能确定
阳性
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未检测到麻疹病毒IgM
应重检测
可能检测到一定浓度的麻疹病毒IgM，提示新近感染
|
抗麻疹病毒抗原抗体IRS小于0.9为阴性；大于1.1是阳性；IRS在0.9到1.1之间是灰区，建议再取一份患者标本做重复实验。
【临床意义】
1.对于任何衣原体种，IgG≥1: 16但＜1: 512，且IgM抗体阴性提示衣原体既往感染。
2.衣原体IgG抗体滴度≥1: 512阳性和（或）IgM抗体≥1: 32阳性，提示衣原体近期感染；急性期和恢复期双份血清IgG抗体滴度4倍及以上升高也提示衣原体近期感染。
3.沙眼衣原体血清学适用于：沙眼衣原体生殖道播散性感染（附睾炎、子宫内膜炎、输尿管炎及盆腔炎）；新生儿沙眼衣原体肺炎（分娩时胎儿通过沙眼衣原体感染的宫颈）；性病淋巴肉芽肿；沙眼衣原体全身系统性感染且合并变态反应，如Fitz-Hugh-Curtis综合征（肝周炎）、Reiter综合征等实验室诊断。
4.肺炎衣原体血清学适用于：肺炎衣原体所致的下呼吸道感染，如气管支气管炎和肺炎的诊断。由于肺炎衣原体下呼吸道感染临床症状和体征无特异性，实验室检测是确诊的依据。临床标本肺炎衣原体分离极为困难，因此，血清学是主要诊断方法。微量免疫荧光试验（micro-immunofluorescence， MIF）是国际上最常用的肺炎衣原体血清学方法，已成为美国CDC推荐方法。
5.鹦鹉热衣原体血清学适用于：人类鹦鹉热的实验室诊断。目前人类鹦鹉热发病率随饲养宠鸟人数的增加有所增加，但总发病率仍然较低。鹦鹉热通常呈不典型肺炎的临床表现，往往发生在接触受染的鸟类（疫鸟）和低等的哺乳类动物。临床症状可以是轻度的或一过性的流感样症状，也可是急性发病，伴有高烧，剧烈的头痛和肺炎，后者可发展为谵妄，低氧血症甚至死亡。鹦鹉热累及心脏时，心电图呈心肌炎改变。另外，鹦鹉热临床表现还可有贫血、反应性肝炎、肝脾肿大、蛋白尿等。鹦鹉热肺部X线主要表现不同程度的肺部浸润，无特异性。
【标本要求】
普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存于-20℃保存。
【方法与原理】
1.方法间接免疫荧光法。
2.原理稀释后的待检血清滴加在沙眼衣原体、肺炎衣原体及鹦鹉热衣原体抗原基质上，如果标本中存在抗体，即与抗原结合，否则被PBS洗去。结合在衣原体抗原上的第一抗体（血清抗体）再与加入的第二荧光抗体结合，如羊或兔抗人免疫球蛋白IgG或IgM荧光抗体，在荧光显微镜下显示荧光染色的衣原体。
【仪器】
日本Nikon公司Diaphot-200荧光显微镜和德国Heidolph公司Paromax2020型洗涤摇床。
【试剂】
1.抗原沙眼衣原体L2／434/Bu株、肺炎衣原体CWL-029（ATCCVR 1310）株和鹦鹉热衣原体6BC株接种BGMK细胞株（绿猴肾细胞），超声波破碎感染细胞，释放衣原体，阶层梯度密度离心纯化衣原体抗原（EBs）。将纯化的沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体抗原分别滴涂在特殊印制的28孔载玻片上，丙酮固定。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在- 20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
2.结合物 兔抗人IgG和羊抗人IgM荧光抗体（Sigma公司产品）。原液分装冻存- 20℃冰箱。使用时取一管化冻，用0.01mol／L的PBS（pH7.2，含0. 025% Evans蓝和0.05%叠氮钠）稀释至工作浓度（稀释度按说明书或方阵预滴定），稀释后的结合物在2～8℃可保存1～2月。
【操作步骤】
试验前将含抗原片的锡纸口袋自-20℃冻箱内取出，置室温至少15分钟，然后剪开锡纸口袋，取出抗原片。待检血清（包括阳性和阴性对照）用0. 01mol／L浓度的PBS（pH7.2）做1: 16、1：64、1: 256、1：512稀释，然后滴加在28孔抗原片上。37℃湿盒内温育30分钟（检测IgM抗体温育90分钟）。PBS洗涤2次，每次2～3分钟，再用蒸馏水冲洗玻片1次，以除去盐分，电风扇吹干。加入工作浓度的兔抗人IgG或IgM荧光抗体，37℃湿盒内温育30分钟（检测IgM抗体也温育30分钟）。同样方法洗涤玻片，甘油封片，荧光显微镜下（×200）观察结果。无论是检测IgG或IgM抗体，镜下见致密、沙粒状颗粒（衣原体原体）荧光染色为阳性。
对于IgM抗体阳性的血清标本，需要进行类风湿因子（RF）吸收试验（另见操作规程），然后重复上述步骤进行检测，结果以吸收后的为准。确定滴度时应考虑到吸收试验过程中时血清的稀释。衣原体IgG抗体阴性，但IgM抗体阳性，RF乳胶吸附试验后IgM抗体仍为阳性，应考虑窗口期的存在。处理方法：2周后复查衣原体IgG和IgM抗体，如果IgG抗体阳转，则为窗口期，判断为近期感染。如果复查IgG抗体仍然为阴性，则考虑IgM抗体假阳性。
【参考范围】
对于任何衣原体种（沙眼、肺炎及鹦鹉热），血清IgG抗体滴度＜1：512，IgM抗体为阴性属于正常范围。
【临床意义】
肺炎支原体抗体滴度≥1: 160为阳性提示肺炎支原体近期感染。
【标本要求】
普通管静脉血标本2ml，常规分离血清，如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。
【方法与原理】
1.方法颗粒凝集法。
2.原理 包被肺炎支原体膜抗原的明胶颗粒在抗体存在条件下发生凝集反应。
【仪器】
微量振荡器。
【试剂】
日本Fujirebio公司产品Serodia-MycoⅡ。
1.U形微孔反应板。
2.血清标本稀释液，100ml/瓶×1瓶，工作浓度。
3.致敏的明胶颗粒（冻干），加入血清标本稀释液溶解，1. 5ml／瓶×5瓶。
4.非致敏的明胶颗粒（冻干），加入血清标本稀释液溶解，0. 5ml／瓶×3瓶。
5.阳性抗体对照，即兔抗肺炎支原体抗体，0. 5ml／瓶×1瓶。
【操作步骤】
1.试验前将所有试剂和材料置于室温15分钟。
2.待检血清做1: 80稀释，分两步进行。第一步：1: 20稀释血清，5μl血清+95μl稀释液，混匀。第二步：取25μl的1: 20稀释的血清+75μl稀释液，再混匀即为1：80稀释。
3.阳性对照血清做1: 10稀释，即10μl血清+90μl稀释液，混匀。阴性对照为血清标本稀释液。
4.取1：80稀释的待检血清，1: 10稀释的阳性对照血清和阴性对照（血清标本稀释液）及弱阳性对照血清分别加入U形板内，每孔25μl，再加入肺炎支原体抗原致敏的明胶颗粒悬液，每孔25μl，振荡混匀，这样待检血清实际为1：160稀释，封上防蒸发胶带，置于室温3小时后观察结果。
5.结果评定标准根据Fujirebio公司凝集反应图形进行。
6.待检血清1: 160稀释凝集阳性时，必须进行非特异性凝集试验：待检血清稀释方法同上，稀释后的待检血清加入U形板内，每孔25μl，再加入非致敏的明胶颗粒悬液，每孔 25μl，振荡混匀，封上防蒸发胶带，置于室温3小时后观察结果。
7.如果非特异性凝集试验阴性，上述1：160稀释凝集阳性的待检血清为真阳性，提示肺炎支原体近期感染。
【参考范围】
正常人可能存在肺炎支原体抗体，但滴度＜1：160。
【参考文献】
1. Abele-Horn M，Busch U，Nitschko H，et aI.Molecular approaches to diagnosis of pulmonary diseases due to MycoPlasma pneumoniae.J Clin Microbiol，1998，36:548-551
2.Tjhie J H，Van Kuppeveld F J，Roosendaal R，et al.Direct PCR enahles detection of Myco plasma pneumoniae in Patients with respiratory tract infectionsJ Clin Microbl01，1994，32:11-16
【临床意义】
阳性提示CMV急性感染。CMVpp65阳性结果实行危急报告制度，即打电话通知临床医生，以便尽早使用抗CMV药物治疗。
【标本要求】
EDTA-K3抗凝的静脉血2～5ml，白细胞过低患者，如＜200个／mm3，需要采集5～10ml抗凝的静脉血。
【方法与原理】
1.方法 间接免疫荧光法。
2.原理 两种抗CMV低基质结构磷蛋白（lower matrix structural phos- phoprotein，CMVpp65抗原）的单克隆抗体滴加在固定后的纯化的白细胞涂片上，如果白细胞核中存在CMV抗原，即与单克隆抗体结合，否则被PBS洗去。结合CMV抗原的单克隆抗体再与加入的第二荧光抗体结合，如羊或兔抗鼠免疫球蛋白IgG荧光抗体，在荧光显微镜下显示荧光染色的白细胞核（CMV抗原）。
【仪器】
英国Shandon公司Cytospin3型细胞离心涂片机、日本Nikon公司Dia-phot-200荧光显微镜和德国Heidolph公司Paromax 2020型洗涤摇床。
【试剂】
荷兰IQ公司产品（CMV BriteTMKit）。
1.试剂A 6%右旋糖酐。
2.试剂B 溶血素。
3.试剂C 固定液。
4.试剂D 打孔液。
5.试剂E 浓缩的洗液。
6.试剂F 鼠抗CMVpp65抗原的单克隆抗体。
7.试剂G 抗鼠IgG荧光抗体。
【操作步骤】
1.分离白细胞
（1）标本要求：EDTA-K3抗凝的静脉血2～5ml（白细胞过低患者，如＜200个／mm3，需要采集5～10ml抗凝的静脉血）。分离白细胞必须在标本采集后6～8小时内完成。
（2）白细胞的分离
a）加入100μl的试剂A（6%右旋糖酐：血标本体积=1：4），混匀，室温倾斜45°放置（25±5）分钟。将富含白细胞的上清和红细胞顶层移置另一试管中，2000转／分钟离心2分钟，弃去上清液。用蒸馏水或去离子水1: 10稀释试剂B或0. 83%NH4Cl（溶血素），并在2～8℃预冷，取5ml稀释后的试剂B或0.83%NH4Cl，再悬浮沉淀的细胞。
b）将标本倒入50ml离心管加0.83%NH4C1（溶血素）至50ml，混匀后放入冰箱，10分钟后，2000转／分钟离心2分钟，弃去上清液。
c）溶血：再悬浮沉淀的细胞混匀后置于2～8℃，10分钟，上述同样条件离心，弃去上清液。如红细胞溶解不完全可重复上述步骤一次。
（3）洗涤：用5ml的PBS再悬浮沉淀的细胞，上述同样条件离心，洗涤一次。
2.细胞计数和浓度调整
（1） 1ml的PBS再悬浮上述沉淀（中性粒细胞＜200个／mm3时，用0. 2mlPBS再悬浮）。
（2）人工或血细胞计数仪计数粒细胞。
（3）PBS调整白细胞浓度为3.0×l06／106/ml。
3.细胞离心涂片
（1）取125μl上述白细胞悬液至细胞离心涂片机内，1000转／分钟离心3分钟。
（2）每份标本涂片2张。
（3）细胞涂片在室温干燥5分钟，也可置于室温过夜。
4.固定和打孔
（1）用蒸馏水或去离子水1:5稀释试剂C（固定液）和D（打孔液），用PBS溶液1: 200稀释试剂E（洗液）。
（2）室温下将2张玻片置于稀释后的试剂C溶液10分钟。
（3）玻片自试剂C取出用洗液轻轻冲洗一次，然后放入洗液内5分钟。
（4）室温将玻片置于稀释的试剂D溶液10分钟，玻片自试剂D取出用洗液轻轻冲洗一次，然后放入洗液内5分钟。
（5）蒸馏水或去离子水轻轻冲洗三次。吹干后立即染色，如置2～8℃可保存24小时。
5.间接荧光染色
（1）记号笔在白细胞涂片周围划圈，笔迹干燥后置于PBS溶液内3～5分钟。余后的操作均保持圈内的涂片不干。
（2）加入试剂F（鼠抗pp65单抗），37℃湿盒内温育30分钟，用0.01mol／L浓度的PBS（pH7.2）冲洗2次，2分钟／次。
（3）加入试剂G（抗鼠IgG荧光抗体），37℃湿盒内温育30分钟，用0. 01mol/L浓度的PBS（pH7.2）冲洗2次，2分钟／次。蒸馏水冲洗2次。
（4）封片后荧光显微镜下观察结果。
6.读片及结果判断
200×镜下观察10～20个视野，可疑阳性染色400×确定。阳性染色位于白细胞细胞核，呈苹果绿或黄绿色荧光，形态呈圆形或分叶核状。每张片能够找到5个及以上荧光染色的细胞核为阳性。
【参考范围】
正常人外周血CMVpp65抗原为阴性。
【临床意义】
1.梅毒密螺旋体是梅毒的病原体。梅毒螺旋体可通过性接触和胎盘传播，也可通过输血和伤口传播。血清学是诊断梅毒主要方法。FTA-ABS IgG抗体，与梅毒螺旋体血细胞凝集试验（Treponema pallidum haemagglutination assay， TPHA）和梅毒螺旋体颗粒凝集试验（Treponema pallidum particle agglutina- tion，TP-PA）等一样，系梅毒螺旋体血清学试验方法，用于确认非梅毒螺旋体血清学试验阳性的标本。
2.CSF-FTA-Ab结果的特异性和敏感性分别为94%和100%，因此FTA-ABS阴性可排除神经性梅毒。
【标本要求】
普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存于-20℃保存。脑脊液（CSF）标本不需处理直接保存于2～8℃冰箱，7天内完成检测。
【方法与原理】
1.方法 间接免疫荧光法。
2.原理 固定在生物薄片载片反应区上的梅毒螺旋体涂片与已稀释的标本温育（稀释的血清及CSF预先与非致病的溃蚀密螺旋体混合反应，以除去非特异性交叉反应性抗体吸附）。如果标本中存在抗梅毒螺旋体IgG抗体，则与载片上的梅毒螺旋体抗原结合，当加入荧光素标记的抗人IgG时再与结合后的抗梅毒螺旋体IgG抗体结合，荧光显微镜下可观察到荧光染色的梅毒螺旋体。
【仪器】
日本OLYMPUS公司BX51荧光显微镜。
【试剂】
德国欧蒙公司产品，试剂盒组成如下：
1. 10张生物薄片载片。
2.1. 5ml荧光素标记的羊抗人IgG抗体，直接使用。
3. 0.1ml抗梅毒密螺旋体抗体阳性对照血清，直接使用。
4.0.1ml抗梅毒密螺旋体抗体阴性对照血清，直接使用。
5.2袋磷酸盐，用于配制pH7.2的缓冲液：使用时每袋溶于1L蒸馏水。
6.2×2ml Tween20 （2ml Tween20加入到1L磷酸盐缓冲液中配成PBS- Tween20缓冲液，用来稀释血清和清洗载片）。
7. 3.0ml封片介质（磷酸盐缓冲甘油pH8.4）。
8. 12张盖玻片（62mm×23mm）。
9.1瓶FTA-ABS吸附剂（冻干品），用5.0ml蒸馏水稀释。
【操作步骤】
1.标本吸附 取10μl患者血清标本与40μl已溶解的溃蚀密螺旋体在试管中混合（1:5稀释），CSF标本sotLi与soyi已溶解的溃蚀密螺旋体在试管中混合（1:2稀释），以上标本混合后放置37℃温育30分钟。
2.标本稀释 温育完毕后在试管中加入配制后的PBS-Tween缓冲液50μl（最终1: 10稀释），CSF标本不再加入PBS-Tween缓冲液（最终1：2稀释）。
3.加样 将加样板放在泡沫塑料板上，加25μl稀释后标本至加样板每一反应区，避免产生气泡（在所有待检标本加完后再开始温育）。
4.温育 将生物薄片载片（抗原基质片）盖在加样板的凹槽里，反应开始。确保每一样品均与生物薄片接触且样品间互不接触，室温温育30分钟。
5.冲洗 用滴管吸取PBS-Tween缓冲液冲洗生物薄片载片两次（倾斜侧面冲洗，勿直接冲洗生物薄片抗原基质区），然后立即将其放入装有PBS-Tween缓冲液的洗缸中至少5分钟，可用旋转摇床进行震荡洗涤。
6.加样滴加20μl荧光素（FITC）——标记羊抗人IgG抗体（结合物）至一洁净加样板的反应区，加完所有结合物后方可继续温育。荧光素标记羊抗人结合物使用前应混匀。
7.温育 从PBS-Tween缓冲液中取出一张生物薄片载片，5秒内用纸巾擦一下背面和边缘后，立即盖在加样板的凹槽里，不要擦拭反应区间隙，尤其避免接触到抗原基质区，导致抗原基质组织或细胞形态破坏或被涂掉。检查生物薄片是否与结合物液滴接触良好，然后进行下一张载片。结合物温育时间为30分钟，并注意避免光线直射载片。
8.冲洗 用滴管吸取PBS-Tween缓冲液冲洗生物薄片载片两次（倾斜侧冲洗，勿直接冲洗生物薄片抗原基质区），然后立即将其放入装有PBS-Tween缓冲液的洗缸中至少5分钟（中间换一次缓冲液），可用旋转摇床进行震荡洗涤。
9.封片 将盖玻片直接放在泡沫塑料板的凹槽里。滴加甘油/PBS至盖玻片：每反应区约20μl，避免封片液过量。从PBS-Tween缓冲液中取出一张生物薄片载片，用纸巾擦干背面和四边，不要擦拭反应区间隙，尤其避免接触到抗原基质区，导致抗原基质组织或细胞形态破坏或被涂掉。将生物薄片载片面朝下放在已滴加封片甘油的盖玻片上，立即查看并调整，使盖玻片嵌入载片的凹槽里。然后继续下一张生物薄片载片。封片后的抗原基质片即可在荧光显微镜下观察结果。
10.结果判断 荧光显微镜下直接观察梅毒螺旋体形态，有无发荧光的螺旋体是判断梅毒螺旋体抗体阳性和阴性的关键。
（1） FTA-ABS:阳性时在荧光显微镜下可见梅毒螺旋体形态清晰，且呈特异性亮绿色荧光。
（2） FTA-ABS:弱阳性时在荧光显微镜下可见梅毒螺旋体形态清晰，且呈特异性亮绿色荧光，但荧光亮度较弱。
（3） FTA-ABS:阴性时则呈非特异性暗绿色荧光，并且梅毒螺旋体形态非常模糊。
【参考范围】
1. 1: 10无反应阴 性，未检出IgG型抗梅毒密螺旋体抗体，但不能排除感染的存在。
2.1: 10有反应且RPR阴性 梅毒感染早期或既往感染。
3. 1: 10有反应且RPR阳性 可疑梅毒感染，应给予治疗。
80.荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验FTA-ABS IgM
【临床意义】
1.血清标本FTA-ABS IgM阳性提示梅毒近期感染，但需结合其他血清学试验综合判断。
2.新生儿血清FTA-ABS IgM阳性提示先天性梅毒的存在。
【标本要求】
普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存于-20℃保存。脑脊液（CSF）标本不需处理直接保存于2～8℃冰箱，7天内完成检测。
【方法与原理】
1.方法 间接免疫荧光法。
2.原理 固定在生物薄片载片反应区上的梅毒螺旋体涂片与已稀释的血清／CSF标本温育（吸附1：稀释的血清/CSF标本预先与非致病的溃蚀密螺旋体混合反应，以除去非特异性交叉反应性抗体吸附；吸附2：温育后，与溃蚀密螺旋体混合反应后的血清/CSF标本与RF吸附剂反应，以预防可能存在的IgM型类风湿因子与特异性结合的IgG反应导致IgM检测的假阳性，也可避免因特异性的IgG与IgM竞争抗原结合位点导致IgM检测的假阳性，标本中的类风湿因子也可被IgG吸附剂去除。）。如果标本中存在抗梅毒螺旋体IgM抗体，则与载片上的梅毒螺旋体抗原结合，当加入荧光素标记的抗人IgM时再与结合后的抗梅毒螺旋体IgM抗体结合，荧光显微镜下可观察到荧光染色的梅毒螺旋体。
【仪器】
日本OLYMPUS公司BX51荧光显微镜。
【试剂】
德国欧蒙公司产品，试剂盒组成如下：
1. 10张生物薄片载片。
2.1.5ml荧光素标记的羊抗人IgM抗体，直接使用。
3. 0.1ml抗梅毒密螺旋体抗体阳性对照血清，直接使用。
4. 0.1ml抗梅毒密螺旋体抗体阴性对照血清，直接使用。
5.2袋磷酸盐，用于配制pH7.2的缓冲液：使用时每袋溶于1L蒸馏水。
6.2×2ml Tween20（2ml Tween20加入到1L磷酸盐缓冲液中配成PBS-Tween20缓冲液，用来稀释血清和清洗载片）。
7.3.0ml封片介质（磷酸盐缓冲甘油pH8.4）。
8. 12张盖玻片（62mmX 23mm）。
9.1瓶FTA-ABS吸附剂（冻干品），用5.0ml蒸馏水稀释。
10. RF吸附剂（德国欧蒙公司产品，需单独订购）。
【操作步骤】
1.标本吸附 取10μl患者血清标本与40μl已溶解的溃蚀密螺旋体在试管中混合（1:5稀释），CSF标本50μl与50μl已溶解的溃蚀密螺旋体在试管中混合（1：2稀释），以上标本混合后放置37℃温育30分钟。
2.标本稀释 取50μl温育后标本加RF吸附剂50μl（最终1：10稀释，CSF1：4稀释），放置室温1 5分钟后，离心2000转／分钟，5分钟，加样。
3.加样将加样板放在泡沫堑料板上，加25弘l离心后上清至加样板每一反应区，避免产生气泡（在所有待检标本加完后再开始温育）。
4.温育 将生物薄片载片（抗原基质片）盖在加样板的凹槽里，反应开始。确保每一样品均与生物薄片接触且样品间互不接触，室温温育30分钟。
5.冲洗 用滴管吸取PBS-Tween20缓冲液冲洗生物薄片载片两次（倾斜侧面冲洗，勿直接冲洗生物薄片抗原基质区），然后立即将其放入装有PBS-Tween20缓冲液的洗缸中至少5分钟，可用旋转摇床进行震荡洗涤。
6.加样 滴加20μl荧光素（FITC）-标记羊抗人IgM抗体（结合物）至一洁净加样板的反应区，加完所有结合物后方可继续温育。FITC标记羊抗人IgM结合物使用前应混匀。
7.结合物温育 从PBS-Tween20缓冲液中取出一张生物薄片载片，5秒内用纸巾擦一下背面和边缘后，立即盖在加样板的凹槽里，不要擦拭反应区间隙，尤其避免接触到抗原基质区，导致抗原基质组织或细胞形态破坏或被涂掉。检查生物薄片是否与结合物液滴接触良好，然后进行下一张载片。结合物温育时间为30分钟，并注意避免光线直射载片。
8.冲洗 用滴管吸取PBS-Tween20缓冲液冲洗生物薄片载片两次（倾斜侧冲洗，勿直接冲洗生物薄片抗原基质区），然后立即将其放入装有PBS-Tween20缓冲液的洗缸中至少5分钟（中间换一次缓冲液），可用旋转摇床进行震荡洗涤。
9.封片 将盖玻片直接放在泡沫塑料板的凹槽里。滴加甘油/PBS至盖玻片：每反应区约20μl，避免封片液过量。从PBS-Tween缓冲液中取出一张生物薄片载片，用纸巾擦干背面和四边，不要擦拭反应区间隙，尤其避免接触到抗原基质区，导致抗原基质组织或细胞形态破坏或被涂掉。将生物薄片载片面朝下放在已滴加封片甘油的盖玻片上，立即查看并调整，使盖玻片嵌入载片的凹槽里。然后继续下一张生物薄片载片。封片后的抗原基质片即可在荧光显微镜下观察结果。
10.结果判断 荧光显微镜下直接观察梅毒螺旋体形态，有无发荧光的螺旋体是判断梅毒螺旋体抗体阳性和阴性的关键。
（1） FTA-ABS:阳性时在荧光显微镜下可见梅毒螺旋体形态清晰，且呈特异性亮绿色荧光。
（2）FTA-ABS:弱阳性时在荧光显微镜下可见梅毒螺旋体形态清晰，且呈特异性亮绿色荧光，但荧光亮度较弱。
（3） FTA-ABS:阴性时则呈非特异性暗绿色荧光，并且梅毒螺旋体形态非常模糊。
【参考范围】
1. 1: 10无反应阴性。未检出IgM型抗梅毒密螺旋体抗体。
2.1: 10有反应梅毒急性感染或处于慢性期，需治疗。
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