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【医疗】神经内科医疗诊疗规范——第一篇神经系统疾病诊断技朮操作常规 第一章 实验室检查技术操作常规
作者:王泓 日期:2014-06-17
脑脊液是流动于脑室及蛛网膜下腔内的一种无色透明液体。成人脑脊液总量为110～200ml，其生成速度为0.35ml/min，每天约生成500ml。在急性或慢性炎症、脑水肿和脉络丛乳头状瘤等情况下，脑脊液分泌明显增多，可达到5000～6000ml/d。正常情况下血液中的各种化学成分只能选择性地进入脑脊液中，这种功能称为血脑屏障。在病理情况下，血脑屏障破坏和其通透性增高可使脑脊液成分发生改变。通常经腰椎穿刺采取脑脊液。
【适应证】
中枢神经系统炎性病变（包括各种原因引起的脑膜炎或脑炎）、脱髓鞘疾病、蛛网膜下腔出血、脑膜癌病、中枢神经系统血管炎及颅内转移瘤的诊断及鉴别诊断；对脊髓病变和多发性神经根病变的诊断及鉴别诊断也有帮助；还适用于脊髓造影和鞘内注射药物治疗等。
【禁忌证】
穿刺部位有化脓性感染或脊椎结核，有出血倾向，血小板＜50000/mm3，以及临床上有脑疝倾向时。
颅内压升高并有明显的视乳头水肿、怀疑后颅窝占位性病变时，应慎重操作。
【操作方法】
患者侧卧位，屈颈抱膝，取腰4～5椎间隙或腰5～骶1椎间隙为穿刺点（沿双侧髂嵴最高点之间的连线与脊椎中线相交处为腰4棘突，其下为腰4～5椎间隙），常规消毒，术者带无菌手套，用3%碘酒消毒，75%酒精脱碘，用2%普鲁卡因在穿刺点做皮内、皮下麻醉。术者用左手固定穿刺部位的皮肤，右手持穿刺针自穿刺点缓慢刺入，刺入韧带时可感受到一定阻力，之后有落空感时提示已刺入蛛网膜下腔，可抽出针芯让脑脊液流出。如没有脑脊液流出可转动穿刺针或将穿刺针退出少许，直到脑脊液流出为止。测定初压，留取脑脊液送检，测定终压，插入针芯，拔出穿刺针，局部敷无菌纱布固定，嘱去枕平卧6小时。
【临床意义】
1.压力高可见于脑水肿、颅内占位性病变、感染、急性脑卒中、静脉窦血栓形成、良性颅内压增高，以及心衰、肺功能不全及肝昏迷等。
2.压力低主要见于低颅压、脱水、脊髓蛛网膜下腔梗阻、脑脊液漏等。
【并发症】
最常见为腰穿后低颅压头痛，可持续2～8天，头痛以额、枕部为著，可伴有颈部和后背痛，咳嗽、打喷嚏或站立时症状加重，严重者还可伴有恶心、呕吐和耳鸣。平卧位可使头痛减轻，应大量饮水，必要时可静脉输入生理盐水。
【常规压力测定】
侧卧位的正常压力为80～180mmH2O＞200mmH2O提示颅内压增高。脑脊液压力测定应包括初压（取脑脊液之前）和终压（取脑脊液之后）。
【压颈试验（Queckenstedt test）】
应先作压腹试验，用手掌深压腹部，脑脊液压力迅速上升，解除压迫后，压力迅速下降，说明穿刺针头确实在椎管内。压颈试验常用指压法，用手指压迫颈静脉15～20秒，然后迅速放松，观察其压力的变化。正常情况下压颈后脑脊液压力迅速上升100～200mmH2O以上，解除压颈后，压力迅速下降至初压水平。如在穿刺部位以上有椎管梗阻，压颈时压力不上升（完全梗阻），或上升、下降缓慢（部分梗阻），称为压颈试验阳性。如压迫一侧颈静脉，脑脊液压力不上升，但压迫对侧上升正常，常指示该侧的横窦闭塞。有颅内压升高或怀疑后颅窝占位性病变者，禁行压颈试验，以免发生脑疝。
正常脑脊液为无色透明液体。如脑脊液为血性或粉红色，可用三管试验法加以鉴别，用三管连续接取脑脊液，前后各管为均匀一致的血色为新鲜出血，可见于蛛网膜下腔出血；前后各管的颜色依次变淡可能为穿刺损伤出血。血性脑脊液离心后颜色变为无色，可能为新鲜出血或损伤；如液体为黄色提示为陈旧性出血。脑脊液如云雾状，通常是由于细菌感染引起细胞数增多所致，见于各种化脓性脑膜炎；脑脊液放置后有纤维蛋白膜形成，见于结核性脑膜炎。脑脊液呈黄色，离体后不久自动凝固，称为弗洛因综合征（Fromn syndrome），常见于椎管梗阻。
正常脑脊液白细胞数为0～5个/mm3，多为单个核细胞。白细胞增多见于脑脊髓膜和脑实质的炎性病变，涂片检查如发现致病的细菌、真菌及脱落的瘤细胞等，有助于病原的诊断。
脑脊液蛋白定性试验（Pandy试验），利用脑脊液中球蛋白能与饱和石炭酸结合形成不溶性蛋白盐的原理，球蛋白含量越高反应越明显，通常作为参考。
【蛋白质】 正常人脑脊液蛋白质含量为0.15～0.45g/L（15～45mg/dl）。蛋白质增高见于中枢神经系统感染、脑肿瘤、脑出血、脊髓压迫症、格林巴利综合征、听神经瘤、糖尿病性神经根神经病、粘液性水肿和全身性感染等。蛋白质降低（＜0. 15g/L）见于腰穿或硬膜损伤引起脑脊液丢失、身体极度虚弱和营养不良者。
【糖】 脑脊液糖含量取决于血糖的水平。正常值为2.5～4.4mmol/L（50～75mg/dl），为血糖的50%～70%。通常脑脊液糖＜2.25mmol/L（45mg/dl）为异常。糖明显减少见于化脓性脑膜炎，轻至中度减少见于结核性或真菌性脑膜炎以及脑膜癌病。糖含量增加见于糖尿病。
【氯化物】 正常脑脊液含氯化物120～130mmol/L（700～750mg/dl）。细菌性和真菌性脑膜炎均可使氯化物含量减低，尤以结核性脑膜炎最为明显。氯化物降低还可见于全身性疾病引起的电解质紊乱等。
【方法】 通常采用玻片离心法。取1～2ml脑脊液，经细胞离心沉淀仪使细胞沉淀在带滤纸孔的玻片上，干燥后以Wright-Giemsa（瑞姬）染色镜检。
【常见的脑脊液细胞】
1.淋巴细胞 小，同形性，核暗而致密，有一个狭窄边缘的灰蓝色胞浆。
2.单核细胞 大，偏心、椭圆、肾形或马蹄形核，染色呈灰蓝色，有大而灰色的核仁，胞浆淡蓝灰色。
3.室管膜细胞 细胞常聚集成团，细胞核圆而致密，偏于一侧，胞浆粉红或蓝灰色。
4.巨噬细胞 单个出现，含胞浆量多少不一样。核呈圆形或椭圆形，有时分叶状，核位于细胞中位或偏位。
5.印戒细胞 为转化的单核细胞，胞浆内含有吞噬物形成的空泡，将胞浆和细胞核挤到边缘部位。
6.浆细胞 只存在于病理情况下，有一个大而居中的细胞核，成熟时胞浆染成亮蓝色，在病毒感染或慢性感染时可见到两个核的浆细胞。
7.淋巴样细胞 外形巨大，核比浆细胞和大淋巴细胞大几倍。
8.中性粒细胞 形态同血中的中性粒细胞。
9.酸性粒细胞 形态同血中的酸性粒细胞。
10.肿瘤细胞 有中枢神经系统原发或转移瘤脱落而来，形态类似原病灶中的瘤细胞。
11.白血病细胞 形态与骨髓或末梢血相似。
12.软骨细胞 由穿刺针所致。
13.造血系统未成熟细胞 因穿刺针损伤椎体骨髓所致。
14.梭形细胞 脑室穿刺的脑脊液中有时可以见到，有一个宽的胞浆边缘。
15.红斑狼疮细胞 罕见。
【脑脊液细胞学正常范围】
正常成年人脑脊液中主要有两类细胞，即淋巴细胞和单核细胞，比例为7:3，偶尔可以见到一些其他细胞。
【生理和病理细胞组成】
众多的脑脊液细胞中，有的是正常生理状态出现的细胞，有的是只有在病理状态下才出现的细胞，识别这些细胞有利于分析脑脊液细胞学检查的临床意义。中枢神经系统化脓性感染可见中性粒细胞增多；病毒性感染可见淋巴细胞增多；结核性脑膜炎呈混合性细胞反应。蛛网膜下腔出血呈无菌性炎性反应和红细胞引起的单核吞噬细胞反应，4～5天后出现含有含铁血黄素的巨噬细胞，后者在出血后数周甚至数月仍可能查到。下表1-1列举了脑脊液中正常和异常情况下的细胞组成。
表1-1 生理与病理状态时的细胞组成
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生理状态下的细胞
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病理状态下的细胞
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1.淋巴细胞
2.单核样细胞
3.软脑膜和蛛网膜细胞
4.室管膜细胞
5.脉络膜细胞
6.来自腰穿的红细胞、粒细胞、
鳞状上皮细胞、软骨细胞等
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1.转化型淋巴细胞（淋巴样细胞）
2.浆细胞
3.激活样单核细胞
4.巨嗜细胞
5.粒细胞
6.红细胞
7.肿瘤细胞
8.狼疮细胞
9.细菌、真菌、髓鞘片段
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寡克隆区带（Oligoclone Band，OB）是检查鞘内免疫球蛋白合成的另一重要方法。在血及脑脊液蛋白电泳检测中，异常的γ球蛋白区带可形成两个或多个细胞克隆活化，造成不连续IgG带群，称之为寡克隆区带，多见于多发性硬化和亚急性硬化性全脑炎等。
【检测方法】
我院采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测脑脊液中寡克隆区带。以双份检测读数的平均值画出标准曲线。根据标准曲线，通过平均吸光度读数找出相对应的MBP浓度，确定对照组或待测液的MBP浓度。
【临床意义】
主要用于多发性硬化、脑白质病、脱髓鞘性周围神经病等疾患的诊断及治疗监测。
中枢和周围神经系统髓鞘均包含糖脂抗原，其中GM1是一种重要的神经节苷酯，血清和脑脊液中抗GM1抗体滴度的高低可反映周围髓鞘和轴索的破坏过程，因此血清中和脑脊液抗GM1抗体含量的测定可作为周围神经髓鞘和轴索受损指标之一。
【方法】
脑脊液标本2ml。应用ELISA法检测。神经节苷脂GMi（购自Sigma公司）用甲醇稀释至5μg/ml。每孔50μl包被96孔酶标板，以200μl 1%牛血清白蛋白（BSA） PBS（pH7. 4）室温孵育2小时，PBS冲洗5次，加100μl待测血清（待测血清用1% BSA-PBS以1：50，1：100，……1：3200系列稀释）置4℃过夜。PBS冲洗5次，冲洗空干后加兔抗人IgM-HRP，稀释度为1：2000，每孔 100μl，室温2小时。PBS冲洗5次，加底物作用30min，2mol/L H2SO4终止反应，测A值，波长450nm。1%牛血清白蛋白PBS做空白对照。如果空白对照A值大于0.2，重复实验。抗GM1抗体的滴度取实测A值减空白对照A值后大于等于0.1的最高血清稀释度。
【临床意义】
抗GM1抗体的测定可用于急性、慢性吉兰-巴雷综合征、多灶性运动神经病、伴血浆异常蛋白的周围神经病、运动神经元病、多发性硬化病人的辅助诊断及疗效的评价。
正常情况下鞘内神经系统不合成免疫球蛋白（Immunoglo- bin G，IgG），当发生神经系统疾病时，有两种原因可使鞘内免疫球蛋白增加，一是血脑屏障破坏，血中免疫球蛋白进入脑脊液中，另一是中枢神经系统免疫性疾病，局部的免疫活性细胞产生免疫球蛋白。因而当评价中枢神经系统免疫性疾病所产生的鞘内IgG合成率增高时，需要除外由于血脑屏障破坏原因所致脑液中免疫球蛋白增加。
【测定方法】
推算中枢神经系统IgG合成率应该先测定四个指标：血白蛋白、脑脊液白蛋白、血IgG和脑脊液IgG。血和脑脊液白蛋白以及IgG的测定方法有多种，包括有免疫扩散、火箭电泳、免疫比浊、ELISA和放射免疫法。本院采用免疫比浊法。测定采用自动免疫生化仪。
【计算方法】
有多种方法推算鞘内IgG合成率，我院采用Touttellotte公式计算24小时IgG合成率。该方法由Tourtellotte于1975年创立，能定量推算出鞘内IgG合成率。其公式为：
IgGsyn=｛［（IgGcsf - IgGs/369） -（Albcsf - Albs/230）］×（IgGs/Albs×0.43）｝×5，式中IgGcsf、IgGs、Albcsf、Albs的表达单位为mg/dl，369为正常情况下血中IgG通过完整血脑屏障进入CSF的比例，由正常血中IgG除以正常脑脊液中IgG而得。同样230为正常情况下血中Alb通过完整血脑屏障进入CSF的比例，由正常血中Alb除以正常脑脊液中Alb而得。0.43为白蛋白与IgG分子量之比。公式的前部份为每100ml脑脊液合成的IgG量，由于脑脊液每日产生量为500ml，故乘以5得到24小时鞘内IgG合成率。本院正常范围为9.9～3.3mg/dl。
其它还有IgG指数、Schuller方法来计算IgG合成率。在此不一一赘述。
【临床意义】
鞘内IgG合成率测定是实验室支持诊断多发性硬化等中枢神经系统免疫疾患的一个指标，对于免疫治疗的疗效能起到监测作用。它可反映中枢神经系统内免疫状态的变化。
线粒体病是由于线粒体功能障碍所导致的一组临床疾病，主要表现为肌肉和／或脑部的症状，因此可分为线粒体肌病和线粒体体肌脑病。大多数患者可伴有乳酸酸中毒和血丙酮酸异常
【检测方法】
我院采用2，4二硝基苯肼显色法。取无蛋白血上清液2ml，加入2，4二硝基苯肼0.7ml，静止10分钟，加入二甲苯2ml，用力摇匀后将下部沉淀分离液弃去，加入10%碳酸钠液4ml，摇匀后取下部水样液2ml加1.5N氢氧化钠混匀显色。正常值为：1.5～2.1 mmol/l。
【临床意义】
线粒体病患者在运动后血乳酸升高，但丙酮酸水平变化不大，因而乳酸／丙酮酸比值变化较大，正常情况下乳酸／丙酮酸值在4～17之间，超过此值为异常，这是筛选线粒体病最敏感的指标。
抗乙酰胆碱受体抗体（anti-AchR-ab）和突触前膜抗体（PrM）是重症肌无力诊断的重要指标。其测定借用不同类型蛇毒对AchR和PrM的选择性结合，通过ELISA法，可分别测定其血清浓度。α银环蛇毒素（α-BGT）与AchR特异性结合，β-银环蛇毒素（β-BGT）与PrM特异性结合。所以，在测定前包被酶标板时，加入α-BGT，测定的是抗AchR抗体，加入β-BGT时，测定的是抗PrM抗体。
【测定方法】
目前我院采用ELISA方法。采用骨骼肌提取液作为粗抗原，再测定血清抗AchR抗体和抗PrM抗体。
将α-BGT或3-BGT用pH9.5的碳酸缓冲液稀释至2μg/ml，加入酶标板，每孔100μl，4℃过夜，封板。加粗提抗原100μl，37℃2小时，洗净，拍干，加原倍待测血清，37℃孵育1小时，洗净，拍干，加入辣根过氧化酶羊抗入IgG，孵育30分钟后加入底物显色，以2M硫酸终止反应。测OD值为P值，正常血清OD值为N值，计算P/N值，抗触前膜抗体（PrM）正常值为小于2，抗突触后膜抗体（anti-AchR-ab）为小于1.5。
【临床意义】
重症肌无力患者血清抗乙酰胆碱受体抗体的阳性率为33%～88%。全身型患者阳性率在80%以上。血清抗乙酰胆碱受体抗体浓度与预后及疾病严重程度无明显相关性。某些其它自身免疫性疾病也可出现抗体阳性。
Titin是与肌肉基本结构、功能以及发育相关的大型纤维样肌肉蛋白。它是骨骼肌和心肌肌节中第三大蛋白质，约占肌纤维重量的10%，是目前所发现的最大的单链蛋白。由27000个氨基酸组成，分子量为3000kDa，在肌纤维中起着蛋白构建、维持静止张力与拉长弹性等作用。Titin的主要免疫原区蛋白为MGT-30，80%～90%的合并胸腺瘤的重症肌无力患者的血清中可检测到抗Titin抗体。
【测定方法】
用ELISA诊断试剂盒进行测定：取96孔酶标板加重组MGT-30抗原（10μg/ml），4℃度过夜，甩干后加入1：10稀释的待检血清100μl，37℃度温箱中孵育2小时，再加1:1000 HRP-SPA，孵育30分钟，甩干后加1：20TMB显色，15分钟后加2M硫酸终止反应。在酶标仪上测定波长450nm处的吸光度，所得值除以阴性对照值，即为待测标本的Titin抗体P/N值。测定结果以试剂盒设定P/N≤1.99为阴性。
【临床意义】
主要用于重症肌无力及胸腺瘤的诊断。
铜氧化酶是一种含铜的蓝色蛋白，95%的血铜存在于该酶中，测定其活性称之为铜氧化酶吸光度测定。
【测定方法】
我院采用盐酸对苯二胺方法，取血清0.1ml加入盐酸对苯二胺、醋酸钠缓冲液、氮化钠、氯化钠等混匀后，用721分光光度计测定OD值，正常值为0.12～0.50。
【临床意义】
肝豆状核变性患者血铜氧化酶吸光度下降。
肿瘤能够在无转移的情况下影响远隔器官的功能称为癌的远隔效应，也称副肿瘤综合征。Hu、Yo和Ri抗原在副肿瘤综合征选择性表达，抗体可出现在一些副肿瘤病人的血清和脑脊液中，多见于小细胞肺癌、卵巢腺癌和乳腺癌。
【方法】
间接免疫荧光法及免疫印迹法
【临床意义】
抗Hu，Yo及Ri抗体可特异性出现在一些副肿瘤综合征患者中（详见下表12）。检测这些抗体对肿瘤的早期诊断及神经系统疾病的鉴别诊断有积极意义。
表1-2 副肿瘤综合征抗Hu、Yo及Ri抗体
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抗体
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抗Hu抗体
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抗Yo抗体
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抗Ri抗体
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临床表现
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女性占80%，吸烟者，95%，平均60岁发病。
疼痛或感觉减退。
假性手足徐动症。
直立位低血压。
吞咽困难。
精神障碍。
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癌症发现前出
现。
共济失调：严重，躯干或肢体性。
构音障碍。
动眼障碍。
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视性眼阵挛。
肌阵挛。
躯干性共济失调。
构音障碍。
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临床类型
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边缘性脑炎
脑干脑炎
脊髓炎
小脑变性
肌阵挛
感觉性周围神经病
植物功能失调
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边缘性脑炎
小脑变性
肌阵挛
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边缘性脑炎
脑干脑炎
脊髓炎
小脑变性
肌阵挛
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肿瘤
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88%为小细胞肺癌，卵巢癌。
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卵巢癌，乳腺癌
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乳腺癌
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靶抗原
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中枢神经系统神经元核蛋白（35～40kDa蛋白）
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小脑蒲肯野细胞浆蛋白
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中枢神经系统神经元核蛋白（55及80kDa）
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见脑脊液髓鞘碱性蛋白（MBP）测定。
见CSF抗神经节苷酯抗体（GM1）测定。
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