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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验51-60
作者:王泓 日期:2014-06-19
细菌室所用培养基主要有五大类：分离培养基、鉴定培养基、增菌培养基、真菌培养基和药敏培养基。
1.分离培养基 包括哥伦比亚血琼脂培养基、中国蓝培养基、巧克力培养基、厌氧血培养基、CCFA培养基、XLD培养基、淋球菌培养基、沙保弱培养基和血培养瓶等。
2.鉴定培养基 包括克氏双糖铁、DNA培养基、10%乳糖、多盐培养基、显色培养基和各种生化反应小管等。
3.药敏培养基 包括MH培养基、MH血琼脂培养基、脑心浸液（BHI）培养基和RPMI1640培养基等。
4.增菌培养基 脑膜炎半固体和BHI增菌肉汤等。
5.真菌培养基 沙保弱培养基、土豆培养基、BHI培养基、显色培养基和玉米吐温80培养基等。
哥伦比亚血琼脂培养基
【培养基成分】
1.Columbia基础，15. 6g。
2.蒸馏水，400ml。
3.脱纤维羊血，20ml。
【制法】
Columbia基础在蒸馏水中溶解后，8磅（1磅=0. 4536千克）20分钟高压灭菌，56℃水浴，最后用无菌操作加入20ml羊血，混匀，倾倒至平皿。
【用途】
适合于临床常见细菌的分离培养，用于普通细菌培养的标本均应接种血培养基。
中国蓝平皿
【培养基成分】
1.中国兰乳糖琼脂，14g。
2.蒸馏水，400ml。
3.玫红酸（1%酒精饱和液），2ml。
【制法】
将前两项混合，8磅20分钟高压灭菌，56℃水浴，然后用无菌操作加入玫瑰红酸2. 0ml，混匀，倾倒至平皿。
【用途】
分离革兰阴性杆菌，玫瑰红酸可抑制革兰阳性细菌的生长。
加有抗生素的巧克力培养基
【培养基成分】
1.胰大豆琼脂（Tryptone soya），16g。
2.蒸馏水，400ml。
3.脱纤维兔血，20ml。
4.NAD母液（3gNAD粉剂加入10ml无菌蒸馏水），2ml。
5.万古霉素母液（0. 45g万古霉素溶于4ml无菌蒸馏水），2ml。
【制法】
将前两项混合溶解，8磅20分钟高压灭菌。下锅后，冷却至80℃，无菌操作加入脱纤维兔血20ml，使之成为巧克力颜色。待冷却至50～60℃无菌操作加入万古霉素母液2ml及NAD母液2ml。培基混匀后分装入90mm平皿。
【用途】
用于分离流感嗜血杆菌，万古霉素可抑制绝大多数阳性菌，血液经80℃处理，红细胞溶解，释放流感嗜血杆菌生长所需的X因子。添加剂中NAD辅酶可提供流感嗜血杆菌生长所需的V因子。
本巧克力培养基若不补充抗生素，即可用于培养脑膜炎奈瑟菌及其他苛养菌。
HTM培养基
【培养基成分】
1.HTM琼脂基础，21. 5g。
（1） Mueller-Hinton琼脂，38. 0g/L。
（2）酵母粉，5.0g／L。
2.蒸馏水，500ml。
3.HTM补充物（OXOID公司，每瓶含量15mg），2ml。
（1）NAD，7. 5mg。
（2）氯化血红素，7.5mg。
【制法】
将前两项混合溶解，8磅20分钟高压灭菌。下锅后，冷却至60～70℃，无菌操作加HTM补充物2ml（补充物1瓶用2ml无菌蒸馏水溶解），混匀后分装入90mm平皿。2～8℃保存4天。
【用途】
嗜血杆菌的药敏试验用（NCCLS推荐用）。接种前菌落稀释使用5ml胰蛋白酶消化的大豆汤。
XLD培养基（xylose-lysine-desoxycholate agar，木糖-赖氨酸-脱氧胆盐琼脂）
【材料】
1.XLD琼脂粉（OXOID），21. 2g。
（1）酵母浸膏，3.0g/L。
（2）L-赖氨酸，5.0g/L。
（3）木糖，3.75g/L。
（4）乳糖，7.5g/L。
（5）蔗糖，7.5g/L。
（6）脱氧胆盐，1.0g/L。
（7）胆盐，5.0g/L。
（8）硫代硫酸钠，6.8g/L。
（9）枸橼酸铁，0.8g/L。
（10）复红，0.08g/L。
（11）琼脂，12. 5g/L。
2.蒸馏水，400ml。
【制法】
两物混合，微波炉加热5分钟至溶解，分装入平皿，XLD培养基不能高压灭菌，否则其成分会被破坏。
【用途】
用于分离临床标本或食物中的沙门菌（Salmonellae sp.）和志贺菌（Shigel-lae sp.）
【XLD培养基反应原理】
1.主要依赖木糖发酵，赖氨酸脱碳基和产生HzS三种反应，将沙门菌和志贺菌从非致病菌中分离鉴别出来。
2.除志贺菌、普罗威登菌（Providence sp）和爱德华杆菌（Edwardsiella sp）外，绝大多数肠杆菌科菌均可发酵木糖，因此在含有木糖的XLD培养基中通过志贺菌的木糖阴性反应把志贺菌鉴定出来。
3.可通过培养基中的赖氨酸，把沙门菌从众多木糖发酵的非致病肠道菌中分离出来。
（1）沙门菌：木糖+，赖氨酸脱羧基+，H2S+，pH呈碱性，菌落红色、透明。
（2）沙门菌和爱德华菌属与培养基中的硫代硫酸钠反应生成H2S，H2S与枸橼酸铁反应生成硫化亚铁黑色沉淀，使菌落中心呈黑色。
（3）埃希菌属、肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属及沙雷菌属则为黄色不透明菌落。
厌氧血琼脂培养基
【材料】
1.哥伦比亚琼脂粉，3. 9g。
2.蒸馏水，100ml。
【制法】 1.两物混合溶解，8磅20分钟高压灭菌，下锅后温度降至50～60℃时，用无菌操作加入脱纤维羊血5ml。再加入无菌氯化血红素和维生素Kl混合液1ml。混匀后分装入90mm平皿。
2.无菌氯化血红素和维生素K1混合液的配制 制备培养基的前一天，用1mol／L的氢氧化钠溶解氯化血红素，过夜充分溶解。第二天加蒸馏水200ml，高压灭菌，冷却后加浓度为10mg／ml的维生素K1 1ml，混匀，2～8℃保存备用。
【用途】
分离临床标本中的厌氧菌。
CCFA培养基
【材料】
1.CCFA琼脂粉，17. 25g。
（1）蛋白胨，40g/L。
（2）Na2 HPO4，5.0g/L。
（3）KH2 PO4，1.0g/L。
（4）MgSO4，0.1g／L。
（5）NaCl，2.0g/L。
（6）果糖，6.0g/L。
（7）琼脂，15. 0g/L。
2.蒸馏水，250ml。
3. 1%中性红（水溶液），0.75ml。
4.蛋黄液，12. 5ml。
蛋黄液配制：取一个生鸡蛋，用肥皂洗净，用70%的酒精浸泡15分钟，取出后，打破上下2个3mm的小孔让蛋清流尽，剩的蛋黄放入一个无菌平皿中加入无菌蒸馏水6ml打匀，取出12. 5ml，加入培养基内即可。
5.CCFA培养基用补充物，1ml。
（1）环丝氨酸，500μg／ml。
（2）头孢西丁，16μg／ml。
【制法】
CCFA琼脂粉，蒸馏水，1%中性红溶液混合，8磅20分钟高压灭菌，冷却至50～60℃。用无菌手续加入已准备好的蛋黄液12.5ml，再加入稀释好的抗生素补充物1ml，混匀倒入90cm平皿。
【用途】
1.分离难辨梭状芽胞杆菌。
2.环丝氨酸和头孢西丁可以抑制大便标本中绝大多数肠道菌，粪肠球菌，葡萄球菌及其他的梭杆菌。
3.难辨梭状芽胞杆菌利用果糖，菌落呈黄色，不分解蛋黄，脂酶，卵磷脂酶均阴性。
淋球菌培养基
【材料】
1.GC琼脂粉，9g。
2.蒸馏水，250ml。
3.抗生素溶液，5ml。
【制法】
1.前两项混合溶解，8磅20分钟高压灭菌，下锅后至80℃左右，加入脱纤维羊血12. 5ml，变成巧克力颜色冷置50～60℃时，无菌手续加入抗生素5ml，混匀到70mm平皿。
2.抗生素溶液配制 取一瓶GC用抗生素加入无菌蒸馏水10ml，溶解后取5ml加入250ml培养基中剩余5ml放入冰箱后冷冻，备用。
【用途】
分离淋球菌。
Mǖller-Hinton药敏培养基
【材料】
1.Mǖller-Hinton干粉，15. 2g。
2.蒸馏水，400ml。
【制法】
以上两物混合，8磅20分钟高压灭菌，每90mm平皿准确定量倾倒25ml培养基。
注：CLSI推荐的阳离子（Ca2+，Mg2+）调节培养基。
【用途】
用于非专性菌，如肠杆菌科、葡萄球菌、肠球菌、非发酵糖菌的药敏试验。
DNA培养基
【材料】
1.DNA琼脂粉，3.9g。
（1）色氨酸酶，20g/L。
（2）脱氧核糖核酸，2g/L。
（3）氯化钠，5g/L。
2.蒸馏水，100ml。
【制法】
前两种试剂混合，8磅20分钟高压灭菌，下锅后倒入70mm直径的平皿。
【用途】
检测细菌是否产生DNA酶，卡他莫拉菌阳性，金黄色葡萄球菌阳性，黏质沙雷DNA酶阳性，大肠杆菌阴性，其他奈瑟菌DNA酶阴性。
6.5%多盐培养基
【材料】
1.Columbia琼脂粉，3.9g。
2.氯化钠，6g。
3.蒸馏水，100ml。
4.脱纤维羊血，5ml。
【制法】
以上三种试剂混合，8磅20分钟高压灭菌，下锅后至60℃左右，加入5ml脱纤维羊血，分装倒入70mm直径的平皿。
【用途】
主要用于鉴别D群链球菌，如肠球菌可在多盐培养基上生长阳性。
克氏双糖铁培养基
1.下层部分
【材料】
（1）1%的蛋白胨水（OXOID干粉），1.5g。
（2）蒸馏水，100ml。
（3）琼脂粉，0.3g。
【制法】
以上各物混合微波炉溶解加热后，分装试管2ml左右，然后8磅20分钟高压灭菌备用。
【用途】
检测细菌动力。
2.上层部分
【材料】
（1）克氏双糖铁（OXOID干粉），22g。
a） Lab-Lemco干粉，3.0g。
b）酵母浸膏，3.0g。
c）蛋白胨，20g。
d） NaCl，5g。
e）乳糖，10g。
f）葡萄糖，1g。
g）枸橼酸铁，0. 3g。
h）硫代硫酸钠，0. 3g。
i）复红，0. 05g。
j）琼脂，12g。
k）加蒸馏水至1000ml。
（2）蒸馏水，400ml。
【制法】
两物混合，8磅20分钟高压灭菌，下锅后加入1%的玫瑰红酸0.6ml，用装好下层的试管加入上层摆成斜面即可。
【用途】
观察细菌对葡萄糖和乳糖的利用、菌株是否产气、菌株的动力、是否产H2S。
10%乳糖培养基
【材料】
1. 1%的胨水（干粉，1.5g）。
2.琼脂粉，2g。
3.乳糖，10g。
4.蒸馏水，100ml。
5.1%酸性复红（水溶液），0. 5ml。
【制法】
将以上各物混合溶解，8磅20分钟高压灭菌。下锅后分装无菌小瓶3～4ml，摆成斜面。
脑膜炎半固体培养基
【材料】
1.胰大豆粉，3. 9g。
2.琼脂粉，0. 3g。
3.蒸馏水，100ml。
【制法】
混合以上各物溶解，8磅20分钟高压灭菌，下锅至50～60℃左右加入小牛血清10ml，将培养基倒入无菌小瓶中3ml左右放入37℃孵箱，第二天观察是否污染。
【用途】
用于脑脊液增菌用。
牛奶培养基（保留菌种用）
【材料】
1.脱脂牛奶粉（OXOID），10g。
2.蒸馏水，100ml。
【制法】
以上两物混合溶解后，8磅高压灭菌10分钟，下锅后分装无菌小瓶，每瓶1. 5ml，放冰箱备用，切勿冻存。
【用途】
用于保存苛养菌，如流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、β溶血链球菌和淋球菌等。
沙保弱琼脂平皿
【材料】
1.沙保罗琼脂（OXOID），26g。
2.蒸馏水，400ml。
【制法】
以上两物混合，8磅高压灭菌20分钟，下锅后至60～70℃后，加入氯霉素注射液0. 16ml（125mg/ml），然后分装培养基于无菌小瓶，放冰箱备用，切勿冻存。
【用途】
分离真菌。
科玛嘉显色培养基
【材料】
1.CHROM琼脂，19. 08g。
2.蒸馏水，400ml。
【制法】
以上两物混合，用微波炉溶解（高火5分钟），倒平皿备用。
【用途】
鉴定念珠菌。
RPMI 1640培养基
【材料】
1.RPMI营养粉，4.16g。
2.葡萄糖，8g。
3.MOPS，13. 8g。
4.琼脂粉，6g。
【配制】
1.将以上前三种成分溶于395ml蒸馏水中，混匀，调pH至7.0，加入琼脂粉。121℃高压灭菌15分钟。冷却至60℃，分装平皿前，加入L-谷氨酰胺母液5ml。
2.L-谷氨酰胺母液的配制
（1） MOPS粉，0.17g。
（2）无菌蒸馏水，5ml。
（3）L-谷氨酰胺，0.12g。
混匀至溶解，无菌过滤，备用。
【用途】
真菌药敏试验。
【临床意义】
淋病是最常见的性传播疾病之一，由淋病双球菌引起，该菌属于奈瑟菌，淋病的诊断主要依据典型的临床表现和实验室检查的阳性结果。男性患者的临床表现较典型，表现为尿急、尿痛及尿道口由黄绿色脓性分泌物等，女性患者表现不典型或无症状，并且女性患者阴道或宫颈杂菌较多，有些细菌形态与奈瑟菌属相似，故不推荐使用革兰染色法检查而应直接培养检查。
【标本要求】
男性尿道、女性尿道或宫颈及其他脓性分泌物等。
【方法与原理】
1.方法革兰染色法。
2.原理细菌在染色过程中如紫色的结晶紫可被脱去并被沙黄或藏红复染为红色，为革兰阴性菌，如不能被乙醇脱色而呈紫色的为革兰阳性菌。
【仪器】
显微镜。
【试剂】
1.试剂 革兰染液（台资珠海贝索生物技术有限公司）。
（1）结晶紫+乙醇。
（2）碘溶液（碘+碘化钾）。
（3）95%乙醇+丙酮。
（4）沙黄+乙醇。
2.材料玻片、拭子、酒精灯及显微镜油等。
【操作步骤】
1.制片 取分泌物直接涂于干净玻片上，风干或火焰固定。
2.革兰染色
（1）加结晶紫染液染色10秒后水洗并甩干。
（2）加碘液染色10秒后水洗并甩干。
（3）加丙酮酒精脱色10～30秒后水洗并甩干。
（4）加沙黄（或藏红）复染10秒后水洗，用滤纸吸干或在空气中干燥后镜检。
3.显微镜检查油镜。
4.结果判断
（1）阳性结果：在白细胞内外发现（少量、中量或大量）革兰阴性肾形双球菌。
（2）阴性结果：在细胞内外未发现革兰阴性肾形双球菌。
【临床意义】
淋球菌培养主要用于淋球菌感染的进一步诊断。
淋病双球菌培养法准确、敏感。因临床症状很轻，或无症状患者，无脓性分泌物其涂片革兰染色镜检无法检出革兰阴性肾形双球菌，可用培养的方法提高阳性率，目前淋球菌培养仍是世界卫生组织推荐的诊断淋病的有效方法。
【标本要求】
尿道、宫颈、阴道、口腔、直肠或眼结膜内新鲜分泌物。注意取材后要保温、保湿。
【方法与原理】
淋病双球菌在GC巧克力平板上生长后（5%CO2环境），据其菌落形态和理化性质作为鉴定的标准。
【仪器】
CO2培养箱、显微镜。
【试剂】
1.氧化酶试剂 0. 5%～1. 0%盐酸四甲基（或二甲基）对苯二胺水溶液，当氧化酶溶液与淋球菌菌落接触时，可使无色透明的淋球菌菌落变为红色，并由红色再变为黑色。
2.培养基 GC巧克力平板（含有GC琼脂基础及抑制杂菌生长的抗菌药物万古霉素和多黏菌素等）。
【操作步骤】
1.取材 尿道、宫颈、阴道、口腔、直肠或眼结膜分泌物。
2.接种 常规接种于淋球菌GC巧克力平板上。
3.培养 培养的最适条件是35～36℃，5% CO2恒温环境，培养36～72小时。
4.鉴定 淋病双球菌可疑菌落直径1mm左右，圆形、光滑、半透明、凸起如水滴状。菌落形态、菌体染色形态及氧化酶试验是实验室初步鉴定淋球菌感染的三个基本标准。
5.注意事项
（1）淋球菌的培养复杂且困难，而正确熟练的取材是培养成功的关键。
（2）培养基的质量、培养环境及培养时间对淋球菌的培养和鉴定影响也很大。
【临床意义】
沙眼衣原体感染是最常见的性传播疾病之一，女性常存在无症状感染。生殖道沙眼衣原体感染经常引起严重的并发症，女性可引起宫颈炎、尿道炎、子宫内膜炎、盆腔炎、异位妊娠和不孕症等，男性可引起尿道炎或附睾炎等。目前统计至少50%以上的非淋菌性尿道炎是由于衣原体感染引起的。胶体金快速衣原体检测卡具有敏感性较高、特异性较好的特点，并可快速得到结果，可作为衣原体感染的临床辅助诊断方法。
【标本要求】
1.男性尿道样品 将男性专用尿道拭子插入尿道2～4cm，旋转停留约3～5秒后取出，立刻放入样品处理管。
2.女性宫颈样品 先用一拭子将宫颈口周围区域多余分泌物擦抹干净，再将专用取样拭子插入宫颈口内旋转停留约15～20秒后取出，立刻放入样品处理管。
【方法与原理】
1.方法 金标免疫层析法。
2.原理 在检测卡的硝酸纤维膜的检测线上固定有抗衣原体属特异性抗原LPS的单克隆抗体，对照线上固定有抗鼠IgG抗体，处理后的样品首先与结合了抗衣原体单克隆抗体的胶体金颗粒混合，并靠毛细管作用向检测线移动，如样品中含有衣原体抗原，则可形成双抗体夹心免疫复合物，并在检测区显色形成一条红线。无论样品中有无衣原体存在，对照区总应出现一条红线。
【试剂】
美国ABI公司产品。
1.试剂 20个检测卡／盒。
2.溶液A 0. 2mol/L NaOH 8ml。
3.溶液B 0. 2mol／L HCI 8ml。
4.材料 独立包装（宫颈）拭子：20个／盒；样品处理管：20个／盒。
【操作步骤】
1.加8滴溶液A，并不断旋转挤压拭子，重复多次。
2.加8滴溶液B，同上处理。
3.滴4滴处理样品溶液于检测卡样品孔中，10～15分钟可准确显示结果。
4.结果判断
（1）阴性：仅在对照区（C）有一条红线。
（2）阳性：对照区（C）和检测区（T）各出现一条红线。
（3）无效结果（试验失败）：对照区（C）无红线出现。
【标本要求】
1.男性 尿道拭子或尿道分泌物。
2.女性 宫颈或阴道分泌物。
【方法与原理】
1.方法 微量微生物培养及药敏。
2.原理 解脲支原体培养基中含尿素和指示剂酚红，在解脲支原体生长过程中可分解培养基中的尿素产生氨，使培养基pH升高，酚红指示剂受pH变化的影响使培养基由黄色变为粉红色。人型支原体在生长过程中可分解精氨酸产生氨，使培养基pH升高，在指示剂作用下，培养基可由黄色变为粉红色。
【仪器】
恒温培养箱。
【试剂】
珠海市生物技术研究所产品。
1.培养及药敏试剂板 20只／盒。
2.培养液 20瓶／盒。
3.无菌矿物油 2瓶／盒。
【操作步骤】
1.试验前将所有试剂放置室温15分钟以平衡至室温温度。
2.阴性对照 取出培养液和试验平板，用无菌吸头吸取100μl培养液加入阴性对照孔（Al）。
3.接种标本 吸取样品培养液100μl加到培养平板其余各孔中。
4.封盖 培养板所用微孔滴加2滴无菌矿物油。
5.培养 将培养板加盖后放入培养箱中35～37℃培养48～72小时。
6.结果判断
（1）以阴性对照孔为标准，在48小时后观察并记录培养结果。阴性结果为培养基颜色无变化（黄色），当培养基由黄色变为透明粉红色时为阳性结果。
（2）药敏观察：培养板上一行为低浓度，下一行为高浓度，结果可记录为敏感、中敏、耐药三种。
【临床意义】
真菌性阴道炎或尿道炎属于性传播疾病，真菌在正常情况下与人体处于共生状态，是条件致病菌，在一定条件下可大量繁殖而致病，如真菌性包皮龟头炎、真菌性阴道炎等，直接镜检为快速准确的真菌检查方法，是临床诊断真菌感染的重要手段。
【标本要求】
尿道、冠状沟、宫颈、阴道分泌物及疱液等。
【方法与原理】
1.方法 KOH湿片法。
2.原理 KOH能溶解角蛋白并且可清除某些细胞成分而不破坏真菌孢子及菌丝，使标本在镜下清晰透明。
【仪器】
显微镜。
【试剂】
1.试剂 10%～30%KOH溶液。
2.材料 载玻片、盖玻片、酒精灯、连柄手术钝刀、刮刀、毛刷及棉棍等。
【操作步骤】
1.取材 尿道、冠状沟、宫颈、阴道分泌物及疱液等涂片。
2.制片 滴加KOH溶液，加盖玻片，用酒精灯加热至透明。
3.显微镜检查 低倍镜。
4.结果判断 阳性结果，镜下可见酵母样真菌孢子、菌丝及假菌丝等。
【标本要求】
女性阴道典型分泌物及后穹隆处分泌物或男性尿道分泌物等。
【方法与原理】
1.方法生理盐水湿片法或悬滴法。
2.原理在生理盐水中可清晰观察到活动的滴虫形态。
【仪器】
显微镜
【试剂】
1.试剂生理盐水。
2.材料载玻片、盖玻片、酒精灯及棉棍。
【操作步骤】
1.制片 用拭子取分泌物直接涂于已滴好生理盐水的载玻片上，加或不加盖玻片（也可涂片后进行革兰染色）。
2.显微镜检查。
3.结果判断 阳性结果，镜下滴虫呈梨形或水滴状无色透明或淡绿色虫体，大小约为（10～30）μm×（5～15）μm，虫体轮廓清楚，可见1～4条鞭毛，运动极为活泼、一般无规则或呈螺旋状，可观察到虫体鞭毛运动及波动膜运动。
【临床意义】
阴虱病是性传播疾病的一种，主要通过性接触引起，表现为毛发部位（主要是阴部）有出血点和丘疹，并伴有轻重不同的瘙痒，镜检阳性及有特定的临床表现即可确诊。
【标本要求】
阴部、肛门、胡须等体毛或可疑虫体。
【方法与原理】
1.方法 KOH湿片法（或生理盐水法）。
2.原理 在KOH或生理盐水中可清晰观察到虫体形态。
【仪器】
显微镜。
【试剂】
1.试剂 10%KOH溶液或生理盐水。
2.材料 载玻片、盖玻片、酒精灯、平头镊子及毛刷等。
【操作步骤】
1.用平头镊子或剪刀取下可疑阴毛或毛发放于载玻片上。
2.加KOH溶液或生理盐水，盖上盖玻片。
3.直接显微镜镜检。
4.结果判断 阳性结果：阴虱虱体呈灰黄色或淡棕色，头部至背部略似梭形，整个虫体长与宽几乎相等，形似螃蟹，有触角和眼各一对，并有一个可伸缩的刺吸式口器，足有3对，前足细长、中足及后足粗大，有钩形巨爪，可牢固抓住毛发，体两侧有疣状突起，雌虱大小约1.5～2. 0mm、雄虱大小约0.8～1. 2mm，阴虱卵呈长圆形，为铁锈色或暗红色，附着于毛发上。
【临床意义】
最终阳性结果提示弓形虫近期感染或既往感染。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）。
2.原理 用纯化的弓形虫抗原包被微孔，将待检稀释血清标本加入微孔，若其中含抗弓形虫IgG，则与包被在微孔上的抗原结合。当微孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，其与微孔中的抗弓形虫IgG结合，最后辣根过氧化物酶催化加入微孔的酶底物反应，呈现蓝色，加入终止液后呈黄色。使用酶标仪测定其吸光度值。
【仪器】
瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWashPlus型洗板机。
【试剂】
Trinity公司，试剂盒组成如下：
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成分
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规格
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代码
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1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可拆分的微孔，直接使用
2.校准品
需稀释
3.阳性质控
需稀释
4.阴性质控
需稀释
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgG，直接使用
6.样本稀释液
直接使用
7.清洗缓冲液
20倍浓缩
8.TMB/底物液
直接使用
9.终止液
直接使用
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12×8
1×0. 4ml
1×0. 04ml
1×0. 4ml
1×16ml
1×30ml
1×50ml
1×15ml
1×15ml
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Antigens coated micro assay plate
Calibrator
Positive control
Negative control
HRP conjugate
Serum dilution plus
Wash buffer solution type
Chromogen/substrate solution type
Stop solution
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【操作步骤】
1.实验前处理
（1）实验前将试剂盒和标本等放置在实验台平衡至室温（21～25℃），摇匀试剂盒内的各种试剂。
（2）将浓缩洗液（50ml）用蒸馏水稀释为1.01工作洗液，混匀。
（3）待检血清标本，阳、阴性质控和校准品稀释：以1: 21用样本稀释液稀释（10μl标本+200μl样本稀释液）。脑脊液标本用样本稀释液以1：10稀释。
2.检测过程
（1）取出需要数量的微孔板条，第一条第一空设空白对照。
（2）在相应微孔中加入100μl稀释后的阳性、阴性质控，校准及患者标本。在空白孔中加入100μl样本稀释液。
（3）将微孔板置于21～25℃室温孵育（25±5）分钟。
（4）用洗板机洗涤微孔板条5次，每次浸泡20秒左右。
（5）洗毕后在纸巾上拍尽残余洗液。
（6）将所有微孔中加入100μl酶结合物（空白孔不加）。
（7）轻拍摇动微孔条，在21～25℃室温孵育（25±5）分钟。
（8）重复第4、5洗涤、拍干步骤。
（9）将所有微孔中加入100μl TMB底物液。
（10）轻拍摇动微孔条，21～25℃室温孵育10～15分钟。
（11）将所有微孔中加入100μl终止液，轻拍摇匀微孔条。
（12）5分钟后，1小时内用酶标仪（450nm波长）检测各孔吸光度。
（13）空白孔吸光值应＜0.150，阴性质控应＜0. 250；标准液应≥0.250；阳性质控应≥0. 500。阴性质控及阳性质控吸光值应在瓶外所标范围内。否则实验无效，必须重做。
3.结果计算
（1）校准平均吸光度值=两校准孔吸光度值之和除以2。
（2）校准因子（用于校准由于室温和孵育时间的波动等引起的实验误差）见瓶标。
（3）临界值=校准平均吸光度值×校准因子。
（4）ISR值=标本吸光度值／临界值
如：校准OD分别为0.38和0.42
平均校准OD=0. 40
校准因子=0. 50
临界值=0. 50×0.40=0.2
患者标本OD=0. 60
ISR值=0.60/0. 20=3.00
【参考范围】
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ISR值
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结果
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解释
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＜0. 9
0. 91～1. 09
＞1.10
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阴性
未能确定
阳性
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未检测到弓形虫IgG，为弓形虫易感个体
应重检测
可能检测到一定浓度的弓形虫IgG，提示新近感染或既往感染
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1.标本抗弓形虫抗体ISR值小于0.9为阴性；大于1.1是阳性；IRS在0.9到1.1之间是灰区。
2.若急性期血清为阴性，而恢复期血清为阳性（即血清转化），则提示为初次感染。
3.双份阳性血清的比较：
急性期1 ISR/急性期2 ISR=0. 8～1.2
恢复期1 ISR/恢复期2 ISR=0. 8～1.2
ISR上升%=（二次样本ISR平均值一首次样本ISR平均值）／首次样本ISR平均值
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ISR上升%
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解释
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＜30%
≥30%
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抗体水平变化不明显，提示无新近感染
抗体水平变化明显，提示新近感染［感染复发、再感染或原发感染（急性期血
清采集太迟）］
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【临床意义】
最终阳性结果提示风疹病毒近期感染或既往感染。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）。
2.原理 用纯化的风疹病毒抗原包被微孔，将待检稀释血清标本加入微孔，若其中含抗风疹病毒IgG，则与包被在微孔上的抗原结合。当微孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，其与微孔中的抗风疹病毒IgG结合，最后辣根过氧化物酶催化加入微孔的酶底物反应，呈现蓝色，加入终止液后呈黄色。使用酶标仪测定其吸光度值。
【仪器】
瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
Trinity公司，试剂盒组成如下：
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成分
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规格
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代码
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1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可拆分的微孔，直接使用
2.校准品
需稀释
3.阳性质控
需稀释
4.阴性质控
需稀释
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgG，直接使用
6.样本稀释液
直接使用
7.清洗缓冲液
20倍浓缩
8.TMB/底物液
直接使用
9.终止液
直接使用
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12×8
1×0. 4ml
1×0. 04ml
1×0. 4ml
1×16ml
1×30ml
1×50ml
1×15ml
1×15ml
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Antigens coated micro assay plate
Calibrator
Positive control
Negative control
HRP conjugate
Serum dilution plus
Wash buffer solution type
Chromogen/substrate solution type
Stop solution
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【操作步骤】
1.实验前处理
（1）实验前将试剂盒和标本等放置在实验台平衡至室温（21～25℃），摇匀试剂盒内的各种试剂。
（2）将浓缩洗液（50ml）用蒸馏水稀释为1.0L工作洗液，混匀。
（3）待检血清标本，阳、阴性质控和校准品稀释：以1: 21用样本稀释液稀释（10μl标本+200μl样本稀释液）。脑脊液标本用样本稀释液以1：10稀释。
2.检测过程
（1）取出需要数量的微孔板条，第一条第一空设空白对照。
（2）在相应微孔中加入100μl稀释后的阳性、阴性质控，校准及患者标本。在空白孔中加入100μl样本稀释液。
（3）将微孔板置于21～25℃室温孵育（25±5）分钟。
（4）用洗板机洗涤微孔板条5次，每次浸泡20秒左右。
（5）洗毕后在纸巾上拍尽残余洗液。
（6）将所有微孔中加入100μl酶结合物（空白孔不加）。
（7）轻拍摇动微孔条，在21～25℃室温孵育（25±5）分钟。
（8）重复第4、5洗涤、拍干步骤。
（9）将所有微孔中加入100μl TMB底物液。
（10）轻拍摇动微孔条，21～25℃室温孵育10～15分钟。
（11）将所有微孔中加入100μl终止液，轻拍摇匀微孔条。
（12）12.5分钟后，1小时内用酶标仪（450nm波长）检测各孔吸光度。 （13）空白孔吸光值应＜0.150，阴性质控应＜0. 250；标准液应≥0.250；阳性质控应≥0. 500。阴性质控及阳性质控吸光值应在瓶外所标范围内。否则实验无效，必须重做。
3.结果计算
（1）校准平均吸光度值=两校准孔吸光度值之和除以2。
（2）校准因子（用于校准由于室温和孵育时间的波动等引起的实验误差）见瓶标。
（3）临界值=校准平均吸光度值×校准因子。
（4）ISR值=标本吸光度值／临界值
如：校准OD分别为0.38和0.42
平均校准OD=0. 40
校准因子=0. 50
临界值=0. 50×0.40=0.2
患者标本OD=0. 60
ISR值=0.60/0.20=3.00
【参考范围】
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ISR值
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结果
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解释
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＜0. 9
0. 91～1. 09
＞1.10
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阴性
未能确定
阳性
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未检测到风疹病毒IgG
应重检测
可能检测到一定浓度的风疹病毒IgG，提示新近感染或既往感染
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1.标本抗风疹病毒抗体ISR值小于0.9为阴性；大于1.1是阳性；IRS在0.9到1.1之间是灰区。
2.若急性期血清为阴性，而恢复期血清为阳性（即血清转化），则提示为初次感染。
3.双份阳性血清的比较：
急性期1 ISR/急性期2 ISR=0. 8～1.2
恢复期1 ISR/恢复期2 ISR=0. 8～1.2
ISR上升%=（二次样本ISR平均值-首次样本ISR平均值）／首次样本ISR平均值
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ISR上升%
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解释
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＜30%
≥30%
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亢体水平变化不明显，提示无新近感染
充体水平变化明显，提示新近感染［感染复发、再感染或原发感染（急性期血青采集太迟）］
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