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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验81-90
作者:王泓 日期:2014-06-19
【临床意义】
1.男性尿道和女性宫颈沙眼衣原体涂片阳性提示沙眼衣原体尿道炎和宫颈炎。
2.眼结膜涂片沙眼衣原体阳性，提示沙眼衣原体包涵体结膜炎，多见于新生儿。
【标本要求】
1.拭子包装为无菌，拭子头材料为藻酸钙（calcium alginate）、涤纶（dacron）、聚酯（polyester）纤维材料制作，柄为塑料或铝质。采集标本时持拭子用力擦下尽可能多的细胞，因为衣原体与细胞相伴随。
2.男性尿道标本采集 将尿道拭子插入尿道3～4cm，用力旋转数周后拨出。采用滚动压挤方式涂片，目的尽可能将更多上皮细胞涂上。干燥后丙酮或无水乙醇固定10～15分钟。
3.女性宫颈标本采集 首先用大号拭子擦去宫颈表面黏液，然后用小号拭子插入宫颈内口1cm左右，用力旋转数周后停留20秒，拨出拭子，注意不要将拭子接触阴道壁。涂片及固定与男性尿道拭子涂片相同。
4.眼结膜涂片 无菌拭子涂擦眼结膜，同样方法涂片和固定。
【方法与原理】
1.方法 直接免疫荧光法。
2.原理 荧光素标记的抗沙眼衣原体单克隆抗体滴加在涂片上，如果标本中存在沙眼衣原体，即与荧光单抗结合，否则被蒸馏水洗去。结合荧光单抗的沙眼衣原体在荧光显微镜下呈荧光染色颗粒。
【仪器】
日本Nikon公司Diaphot-200荧光显微镜。
【试剂】
芬兰Orion Diagnostica公司产品，荧光素（FITC）标记的抗沙眼衣原体种特异性单克隆抗体（Chlamyset AG）。
【操作步骤】
将荧光素（FITC）标记的抗沙眼衣原体种特异性单克隆抗体滴加在标本涂片上（已用丙酮或无水乙醇固定），37℃湿盒内温育30分钟。用蒸馏水泡洗2次，2分钟／次，吹干，封片后在荧光显微镜下观察结果（×200筛察，×400确认）。荧光染色的沙眼衣原体呈圆形针尖大小，染色及亮度均匀，呈苹果绿。每张片能够找到10个及以上荧光染色的沙眼衣原体为阳性。
【参考范围】
阴性。
【临床意义】
最终阳性结果提示衣原体感染。
【标本要求】
1.标本采集
（1）宫颈标本：用大棉签拭去宫颈口外的分泌物；将另一棉签插入宫颈管内2～3cm；转动棉签2～3圈后取出棉签，勿接触任何阴道壁，放入传送管中；于数标记处拆除棉签杆，盖紧管盖（需使用MicroTrak提供的衣原体EIA专用采样盒）。
（2）男性尿道标本：将小棉签插入尿道3～4cm，转动2～3圈后取出置于采样管中，于数标记处拆除棉签杆，盖紧管盖（嘱患者采样前1小时内勿小便；若尿道口有分泌物，应先查淋球菌。）（需使用MicroTrak提供的衣原体EIA专用采样盒）。
（3）男性尿液标本：采集5ml初段尿，不要求晨尿（嘱患者采样前1小时内勿小便；若尿道口有分泌物，应先查淋球菌）。
（4）结膜标本：用小棉签拭擦睑结膜；将棉签置于试管中，于数标记处拆除棉签杆，盖紧管盖（若两眼需同时采集，先采症状轻一眼）。
2.标本准备
（1）宫颈、尿道及眼结膜标本：在标本试管中加入1ml标本处理液。
（2）男性尿液标本：取4ml尿至聚丙烯试管中，2000×g离心15分钟。在尿沉渣中加入1ml标本处理液。
（3）摇匀阳性质控（60秒）、阴性质控，立即吸取100μl至相应标记试管（含1ml标本处理液）中。
（4）将标本及质控置于已预热板（95～100℃）上15分钟，之后置于管架冷却10分钟。挤尽液体后弃去棉签。
注意：若采集的标本当天不能安排检测，则在放置标本的试管中加入1ml标本处理液后，放置2～8℃可储存1～2周。务必在使用前平衡到室温后才能进行加热处理。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay， ELISA）。
2.原理 将兔抗衣原体脂多糖（LPS）抗体加入微孔中，然后加入处理后的标本并孵育，若存在衣原体抗原，则与抗体形成Ag-Ab复合物，并黏附在微孔上，未结合的物质被冲洗掉。在微孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体，其与微孔上黏附的兔抗体结合，冲洗除去为结合物质。加入底物与酶反应，使微孔呈蓝色，最后加入的终止液使微孔呈黄色。分光光度计在450nm参考波长为630nm下检测得到吸光值。
【仪器】
瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
Trinity公司，试剂盒组成如下：
|
成分
|
规格
|
代码
|
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1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个微孔（不可拆分），直接使用
2.标本处理液（红色）
直接使用
3.抗体试剂（蓝色）（含兔抗LPSIgG）
直接使用
4.阳性质控
需稀释
5.阴性质控
需稀释
6.酶结合物
辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔
IgG抗体，直接使用
7.浓缩冲洗液（绿色）
通用试剂，20倍稀释
8.底物A（含尿素一过氧化氢）
通用试剂，直接使用
9.底物B（含四甲二砷）
通用试剂，直接使用
10.终止液（含1NH2SO4）
通用试剂，直接使用
|
12×8
1×100ml
1×14ml
1×1.0ml
1×1.0ml
1×14ml
1×100ml
1×15.5ml
1×15.5ml
1×26ml
|
Microwellassaystrips
Specimentreatmentsolution
Antibodyreagent
Positivecontrol
Negativecontrol
Enzyme-antibodyconjugate
Washconcentration
SubstrateA
SubstrateB
Stopsolution
|
【操作步骤】
1.实验前处理
（1）实验前将未打开的封口袋、实验组分和标本等平衡至室温（21～25℃）。摇匀。
（2）将浓缩冲洗液（100ml）用去离子化水／或蒸馏水稀释为2L冲洗液，摇匀。浓缩冲洗液。
2.检测过程
（1）取出需要数量的微孔条，做标记，每板设3个阴性质控孔、1个阳性质控孔。
（2）在所有微孔中加入100μl抗体剂；在标本孔中加入100μl患者标本；在质控孔中分别加入100μl质控剂。
（3）将微孔板置于（37±2）℃孵育（90±5）分钟。
（4）冲洗所有微孔5次（每孔注入300）μl冲洗液，每次浸泡10秒）。
（5）将微孔条倒置在吸水纸上，拍干。
（6）在所有微孔中加入100μl结合物。
（7）轻拍摇匀微孔条，（37±2）℃孵育（30±5）分钟。
（8）重复第4（冲洗）、5（拍干）步骤。
（9）在所有微孔中加入100μl底物（先加入50μl底物B，再加入50μl底物A；或者将底物A和B等量配好后加入）。
（10）振荡摇匀微孔条。（37±2）℃孵育（30±2）分钟。
（11）在所有微孔中加入100μl终止液，轻拍摇匀微孔条。5分钟后，1小时内读取吸光值。
（12）用酶标仪（450nm波长）检测各孔吸光值（若用双波长光，应设置在600～650nm）。酶标仪以空气调零，阅读整板吸光值（O.D）。
（13）结果计算
a）计算阴性质控平均值及临界值（平均阴性质控值+0.20）：
例如：各阴性质控值=0.128，0.083，0.065
平均阴性质控值=（0.128+0. 083+0. 065）／3=0. 092
临界值（cut-off） =0. 092+0. 20=0. 292
b）若某一阴性质控值与平均值之差＞0. 050，则应以另两个值计算；阴性质控平均值应＜0. 200；阳性质控与阴性质控之差应＞0. 800。
【参考范围】
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标本吸光值
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结果
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解释
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＜临界值×75%
临界值×75%～临界值×125%
＞临界值×125%
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阴性
灰区
阳性
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未检到衣原体抗原
不确定
检测到衣原体抗原
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【临床意义】
大多数EB病毒感染为隐性感染。EB病毒感染后，几乎所有患者血清中可检出抗EB病毒抗体。通常情况下，抗体可携带终生。成人EB病毒的感染率为80%。当机体的免疫防御功能减弱时，既往感染的EB病毒可再次激活。
本试验为定性试验，临床意义较为局限，即双份标本存在抗EB病毒IgG抗体阳转时，则实验室诊断EBV原发性感染。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）。
2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被EB抗原成分的酶免疫反应板上，在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗EB病毒抗原成分的抗体，则特异性地与酶免疫反应板上的EB病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgG类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgG抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗EB病毒抗原抗体浓度成正比。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【仪器】
瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
欧蒙公司，试剂盒组成如下：
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成分
|
颜色
|
规格
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代码
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1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品1
200RU/ml（IgG，人），直接使用
3.标准品2
20RU／ml（IgG，人），直接使用
4.标准品3
2RU/rnl（IgG，人），直接使用
5.阳性对照
（IgG，人），直接使用
6.阴性对照
（IgG，人），直接使用
|
—
深红
红色
浅红
蓝色
绿色
|
12×8
1×2.0ml
1×2.0ml
1×2.0ml
1×2.0ml
1×2.0ml
|
Strips
CAL1
CAL2
CAL3
Poscontrol
Negcontrol
|
续表
|
成分
|
颜色
|
规格
|
代码
|
|
7.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgG（兔），直接
使用
8.标本缓冲液
直接使用
9.清洗缓冲液
10倍浓缩
10.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
11.终止液
0.5mol／L硫酸，直接使用
|
绿色
浅蓝
无色
无色
无色
|
1×12ml
1×100ml
1×100ml
1×12ml
1×12ml
|
Conjugate
Samplebuffer
Washbuffer10×
Substrate
Stopsolution
|
【操作步骤】
1.标本稀释用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本，如取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀）。CSF标本1: 10稀释。
2.加样按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgG）至每一微孔。
6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
7.清洗 重复4步骤清洗。
8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
12.结果判定 可通过以下公式计算对照血清或标本吸光度与标准品2吸光度的比值，半定量计算结果：
出现可疑结果时，应于7日后再次采集标本，并与上次采集的标本同时检测，以进行比较。
【参考范围】
标本的吸光度与标准品吸光度比值小于0.8为抗EB病毒IgG抗体阴性，大于1.1是阳性；比值在0.8到1.1之间为灰区，建议再取一份患者标本做重复实验。
【临床意义】
阳性提示EB病毒近期感染。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay， ELISA）。
2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被EB病毒抗原成分的酶免疫反应板上，首先用含有欧蒙IgG/RF吸附剂的缓冲液稀释标本，去除标本中的IgG和RF.以检测特异性IgM。在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗EB病毒抗原成分的抗体，则可以特异性地和酶免疫反应板上的EB病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgM类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgM抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗EB病毒抗原抗体浓度成正比，可根据试剂盒中标准血清测定结果半定量计算出患者标本中抗EB病毒抗原抗体浓度。
【仪器】
瑞士TECAN公司SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
欧蒙公司，试剂盒组成如下：
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成分
|
颜色
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规格
|
代码
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|
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（lgM，人），直接使用
3.阳性对照
（IgM，人），直接使用
4.阴性对照
（IgM，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM（兔），直接
使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液0.5mol／L硫酸，直接使用
|
—
浅红
蓝色
绿色
绿色
浅蓝
无色
无色
无色
|
12×8
1×2.0ml
1×2.0ml
1×2.0ml
1×12ml
1×100ml
1×100ml
1×12ml
1×12ml
|
Strips
CAL3
Poscontrol
Negcontrol
Conjugate
Samplebuffer
Washbuffer10×
Substrate
Stopsolution
|
【操作步骤】
1.标本稀释用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本。如，可取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀），室温静置30分钟。
2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgM）至每一微孔。
6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
7.清洗 同第4步骤清洗。
8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
11.比色 450nm比色波长，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
12.结果判定
半定量：按以下公式计算对照血清或患者标本吸光度与标准品吸光度的比值。
半定量估计结果：比值=对照血清或患者标本的吸光度值／标准品的吸光度值。
【参考范围】
比值＜0.8，判断为阴性。
比值≥0.8至＜1.1，判断为可疑，建议复查。
比值≥1.1，判断为阳性。
【临床意义】
EBV-CA-IgA对鼻咽癌诊断具有较高敏感性，可作为鼻咽癌高危人群临床筛查的重要指标。并且其滴度随着病情的进展和肿瘤转移范围的扩大而增加，经过放疗后病情好转患者血清EBV-CA-IgA滴度下降，而肿瘤复发时EBV-CA-IgA滴度再次上升，因此EBV-CA-IgA可作为鼻咽癌的诊断、治疗及预后判断的指标。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay，ELISA）。
2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被EB抗原成分的酶免疫反应板上，在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗EB病毒抗原成分的抗体，则特异性地与酶免疫反应板上的EB病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgA类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgA抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗EB病毒抗原抗体浓度成正比。
【仪器】
瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
欧蒙公司，试剂盒组成如下：
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成分
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颜色
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规格
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代码
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1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（IgA，人），直接使用
3.阳性对照
（IgA，人），直接使用
4.阴性对照
（IgA，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgA（兔），直接
使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液0.5mol/L硫酸，直接使用
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—
浅红
蓝色
绿色
绿色
浅蓝
无色
无色
无色
|
12×8
1×2.0ml
1×2.0ml
1×2.0ml
1×12ml
1×100ml
1×100ml
1×12ml
1×12ml
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Strips
CAL3
Poscontrol
Negcontrol
Conjugate
Samplebuffer
Washbuffer10×
Substrate
Stopsolution
|
【操作步骤】
1.标本稀释 用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本，如取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀）。CSF标本1: 10稀释。
2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgA）至每一微孔。
6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
7.清洗 重复4步骤清洗。
8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。比色：450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
11.结果判定 可通过以下公式计算对照血清或标本吸光度与标准品吸光度的比值，半定量计算结果：
出现可疑结果时，应于7日后再次采集标本，并与上次采集的标本同时检测，以进行比较。
【参考范围】
1.比值＜0.8，判断为阴性。
2.比值≥0.8至＜1.1，判断为可疑，建议复查。
3.比值≥1.1，判断为阳性。
【临床意义】
EBV- EA-IgA抗体只在疾病的急性期短暂出现，但该抗体在传染性单核细胞增多症中的阳性发生率为70%～80%。高滴度的EBV-EA-IgA提示慢性感染或感染后复发。此外，抗EBV-EA-IgA抗体与伯基淋巴瘤和鼻咽癌也有关。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay， ELISA）。
2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被EB抗原成分的酶免疫反应板上，在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗EB病毒抗原成分的抗体，则特异性地与酶免疫反应板上的EB病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgA类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgA抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗EB病毒抗原抗体浓度成正比。
【仪器】
瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
欧蒙公司，试剂盒组成如下：
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成分
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颜色
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规格
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代码
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1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU/ml（IgA，人），直接使用
3.阳性对照
（IgA，人），直接使用
4.阴性对照
（IgA，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgA（兔），直接
使用
6.标本缓冲液
直接使用
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—
浅红
蓝色
绿色
绿色
浅蓝
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12×8
1×2.0ml
1×2.0ml
1×2.0ml
1×12ml
1×100ml
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Strips
CAL3
Poscontrol
Negcontrol
Conjugate
Samplebuffer
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续表
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成分
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颜色
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规格
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代码
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7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液
0.5moI／L硫酸，直接使用
|
无色
无色
无色
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1×100ml
1×12ml
1×12ml
|
Washbuffer10×
Substrate
Stopsolution
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【操作步骤】
1.标本稀释 用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本，如取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀）。CSF标本1：10稀释。
2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgA）至每一微孔。
6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
7.清洗 重复4步骤清洗。
8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
12.结果判定可通过以下公式计算对照血清或标本吸光度与标准品吸光度的比值，半定量计算结果。
出现可疑结果时，应于7日后再次采集标本，并与上次采集的标本同时检测，以进行比较。
【参考范围】
1.比值＜0.8，判断为阴性。
2.比值≥0.8至＜1.1，判断为可疑，建议复查。
3.比值≥1.1，判断为阳性。
【临床意义】
猪囊虫感染（囊虫病）的辅助实验室诊断。
【标本要求】
1.普通管静脉血2～3ml，常规分离血清后，2～8℃保存7天。
2.避免使用溶血、浑浊或脂血标本及反复冻融标本。
【方法与原理】
1.方法间接酶联免疫吸附法。
2.原理微孔条预包被纯化抗原与血清中囊虫抗体反应，加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG与之结合，辣根过氧化物酶催化底物显色。
【仪器】
1.酶标仪。
2. 37℃恒温水箱。
3.微量振荡器。
【试剂】
深圳博卡生物技术有限公司产品。
1.进口抗原预包被反应条，12×4条。
2.酶结合物（抗人IgG酶标抗体），1支×6ml。
3.浓缩洗液（20倍），1支×10ml。
4.样本稀释液，1支×25ml。
5.阴、阳性对照品，各1支。
6.显色剂A、显色剂B，各1支。
7.终止液，1支。
8.说明书，1份。
【操作步骤】
1.配制洗涤液 1支浓缩洗涤液20倍稀释。
2.样本稀释 待测血清用样本稀释液1: 50稀释（490μl稀释液加10μl血清，脑脊液不稀释），建议样本稀释液每人份每次不超过500μl用量。
3.加样 加入已稀释的标本，每孔100μl，并设空白、阴性、阳性对照个一孔。阴性、阳性对照各加每孔100μl（直接用，不稀释），空白对照（加样本稀释液），置37℃温育30分钟。
4.洗板 用洗板机洗涤微孔板条3～5次，每次浸泡20秒左右。
5.加酶结合物 每孔加酶结合物2滴，置37℃温育30分钟。
6.洗板 用洗板机洗涤微孔板条3～5次，每次浸泡20秒左右。
7.显色 每孔加显色剂A、显色剂B各一滴（或50μl）混匀，37℃10分钟。
8.将所有微孔中加入1滴（或50μl）终止液，轻拍摇匀微孔条。
9.用酶标仪（450nm波长）检测各孔吸光度。
10.结果计算
（1）临界值（C.O.）=阴性对照OD值×2.1（阴性对照OD值＜0.1以0.1计）。
（2）阳性：样本OD值S/C.O.≥1（S/CN≥2.1）。
（3）阴性：样本OD值S/C.O.＜1（S／CN＜2.1）。
在临界值附近的样品，应重复检测，并结合临床症状综合判断。
【参考范围】
阴性。
【临床意义】
用于甲型流感病毒感染的辅助诊断。
【标本要求】
采集样本的无菌拭子推荐使用聚丙烯（PP）杆的聚酯海绵拭子。
1.鼻腔分泌物采集 收集鼻腔分泌物时，将拭子插入鼻腔中分泌物最多处，轻轻转动并向鼻腔内部推动拭子，直至鼻甲（离鼻孔约2. 0～2. 5cm）受阻处，贴鼻腔壁旋转拭子三次，取出拭子。
2.咽喉分泌物采集 将拭子从口腔完全插入咽喉肿，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部，取出拭子。
3.标本采集后应尽快采用病毒采样液或本试剂盒提供的样本提取液进行处理。如不能立即处理，标本应立即置于干燥、消毒并严格密封的塑料管内储存，2～8℃下可保存8小时，-70℃可长期保存。
【方法与原理】
1.方法 胶体金法。
2.原理 本品利用免疫层析技术，采用双抗体夹心法检测A型流感病毒抗原。检测时，将处理后的待测样品滴加于测试卡的加样孔，当待测样本中含有A型流感病毒抗原且抗原浓度高于最低检出量时，A型流感病毒抗原先和标记抗体形成反应复合物，在层析作用下，反应复合物沿着硝酸纤维膜向前移动，被硝酸纤维膜上检测区（T）预先包被的流感A核蛋白单克隆抗体捕获，在检测区上最终形成一条红色／粉色反应线，此时结果为阳性；相反，当待测样本中不含A型流感病毒抗原或抗原浓度低于最低检出量时，则检测区无红色／粉色反应线出现，此时结果为阴性。无论样本是否含有A型流感病毒抗原，质控区（C）都会形成一条红色／粉色反应线，质控区（C）内所显现的红色／粉色反应线是判定层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
【试剂】
试剂盒由测试卡、样本提取液、样本提取管、滴头、使用说明书和合格证组成。
1.测试卡由硝酸纤维膜、玻璃纤维、滤纸、PVC板、塑料盒等其他支持物组成，硝酸纤维膜包被有流感A核蛋白单克隆抗体和抗鼠IgG多克隆抗体。
2.样本提取液主要为磷酸盐缓冲液（PBS） （0.1mol／L，pH7.2±0.2）。
【操作步骤】
测试前将所有试剂恢复至室温，测试应在室温下进行。
1.样本提取
（1）在样本提取内垂直加入400μl（约10滴）样本提取液。
（2）将采样后的拭子插入样本提取管中溶液内，仅靠管壁内旋约10次，使标本尽可能溶解在溶液中。
（3）沿提取管内壁挤压拭子的签头，使液体尽可能的留在管内，取出并弃去拭子。
（4）盖上滴头。
2.检测程序
（1）沿铝箔袋撕口打开，将测试卡取出，平放。
（2）向测试卡的加样孔中滴加入80μl（约3～4滴）处理后的样本提取物或直接加入80μl处理后的病毒采样液。
（3）15～20分钟内观察显示结果，在30分钟后显示的结果无临床意义。
3.检验结果的解释
（1）阳性：两条红色／粉色反应线，即在检测区（T）及质控区（C）各出现一条红色／粉色反应线。
（2）阴性：一条红色／粉色反应线，即仅在质控区（C）出现一条红色／粉色反应线。
（3）无效：质控区（C）无红色／粉色反应线出现，检测无效，建议此时用新测试卡重新检测。
反应线显色深浅与提取样本中所含的被检测物质含量有关，无论颜色强度多少，都应按照反应线是否显色判定结果。
【临床意义】
最终阳性结果提示嗜肺军团菌近期感染或既往感染。
【标本要求】 1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）。
2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被嗜肺军团菌抗原成分的酶免疫反应板上，在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗嗜肺军团菌抗原成分的抗体，则特异性地与酶免疫反应板上的嗜肺军团菌抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgG类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgG抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗嗜肺军团菌抗原抗体浓度成正比。
【仪器】
瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
欧蒙试剂盒内试剂组成：
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成分
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颜色
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规格
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代码
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1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品1
200RU/ml（IgG，人），直接使用
3.标准品2
20RU/ml（IgG，人），直接使用
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—
深红
红色
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12×8
1×2.0ml
1×2.0ml
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Strips
CAL1
CAL2
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续表
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成分
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颜色
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规格
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代码
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4.标准品3
2RU/ml（IgG，人），直接使用
5.阳性对照
（IgG，人），直接使用
6.阴性对照
（IgG，人），直接使用
7.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgG（兔），直接
使用
8.标本缓冲液
直接使用
9.清洗缓冲液
10倍浓缩
10.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
11.终止液
0.5mol／L硫酸，直接使用
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浅红
蓝色
绿色
绿色
浅蓝
无色
无色
无色
|
1×2.0ml
1×2.0ml
1×2.0ml
1×12ml
1×100ml
1×100ml
1×12ml
1×12ml
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CAL3
Poscontrol
Negcontrol
Conjugate
Sample
buffer
Wash
buffer10×
Substrate
Stopsolution
|
【操作步骤】
1.标本 稀释用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本，如取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀）。CSF标本1: 10稀释。
2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgG）至每一微孔。
6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
7.清洗 重复4步骤清洗。
8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
12.结果判定 可通过以下公式计算对照血清或标本吸光度与标准品吸光度的比值，半定量计算结果：
【参考范围】
1.比值＜0.8，判断为阴性。
2.比值≥0.8至＜1.1，判断为可疑，建议复查。
3.比值≥1.1，判断为阳性。
出现可疑结果时，应于7日后再次采集标本，并与上次采集的标本同时检测，以进行比较。
90.抗嗜肺军团菌抗体IgM检测
【临床意义】
最终阳性结果提示嗜肺军团菌近期感染。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay， ELISA）。
2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被嗜肺军团菌抗原成分的酶免疫反应板上，在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗嗜肺军团菌抗原成分的抗体，则特异性地与酶免疫反应板上的嗜肺军团菌抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgM类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgM抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗嗜肺军团菌抗原抗体浓度成正比。
【仪器】
瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
欧蒙试剂盒内试剂组成：
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成分
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颜色
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规格
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代码
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1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（IgM，人），直接使用
3.阳性对照
（IgM，人），直接使用
4.阴性对照
（IgM，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM（兔），直接
使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液
0.5mol／L硫酸，直接使用
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—
浅红
蓝色
绿色
绿色
浅蓝
无色
无色
无色
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12×8
1×2.0ml
1×2.0ml
1×2.0ml
1×12ml
1×100ml
1×100ml
1×12ml
1×12ml
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Strips
CAL3
Poscontrol
Negcontrol
Conjugate
Sample
buffer
Washbuffer10×
Substrate
Stopsolution
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【操作步骤】
1.标本 稀释用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本，如取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀）。CSF标本1: 10稀释。
2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgM）至每一微孔。
6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
7.清洗 重复4步骤清洗。
8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
12.结果判定 可通过以下公式计算对照血清或标本吸光度与标准品吸光度的比值，半定量计算结果：
【参考范围】
1.比值＜0.8，判断为阴性。
2.比值≥0.8至＜1.1，判断为可疑，建议复查。
3.比值≥1.1，判断为阳性。
出现可疑结果时，应于7日后再次采集标本，并与上次采集的标本同时检测，以进行比较。
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